代谢组学在恶性肿瘤早期诊断中的应用

周红光，陈海彬，俞晓忆，王瑞平，吴勉华

（1.南京中医药大学第一临床医学院西医内科学教研室，江苏 南京 210046；2.南京中医药大学附属医院肿瘤内科，江苏 南京 210029；3.南京中医药大学科技处，江苏 南京210046；4.中国药科大学药物代谢动力学实验室，江苏 南京 210009）

恶性肿瘤是严重危害人类健康的疾病之一，是当今世界的主要致死原因。恶性肿瘤的早期诊断是提高其总生存期的途径之一，迫切需要新型策略以发现可用于肿瘤早期诊断的生物标志物并将分子诊断从实验研究转化至临床实践[1－2]。代谢组学是系统生物学的一个重要分支，作为一门新兴热门的 “组学”技术，已在全球范围内展示出强劲的发展势头。目前，代谢组学在发现生物标记物[3]、疾病早期诊断[4]、发病机制的研究[5]及药理药效的评价等方面都发挥着重要作用[6]，已被成熟应用到恶性肿瘤[7－8]、心脏病[9－10]、糖尿病[11－12]等 重 大 疾 病 研 究 当 中。 代 谢 组 学 作 为肿瘤学的研究方法之一，能从代谢的角度整体分析疾病，在恶性肿瘤早期诊断方面的研究已初显优势。本文作者介绍了代谢组学的研究状况及研究技术，着重论述代谢组学为恶性肿瘤早期诊断研究提供了新的思路及其在恶性肿瘤早期诊断研究中的应用，重点介绍了代谢组学在筛选肿瘤相关生物标志物及肿瘤鉴别诊断等方面内容，并对其今后的发展趋势作出展望，以推进代谢组学在恶性肿瘤领域的应用。

1 代谢组学概述

1999年，英国皇家理工大学Nicholson教授首次提出了 “代谢组学”的概念[13]。代谢组学通过采用核磁共振谱（NMR）和质谱（MS）等多种高通量、高分辨、高灵敏度的现代仪器分析手段，定性定量检测生物体液（包括尿液、血浆或血清、唾液、脑脊液、精液等）中尽可能多的内源性代谢物，即代谢组，结合模式识别等化学信息学技术，分析生物体在病理生理刺激和遗传因素改变的条件下，在不同时间、多方位定量检测其代谢变化，通过测定整个机体的系统代谢图谱来揭示生物内源性代谢物质在特定时间、环境下的整体功能状态及其对内因和外因变化应答规律的一门学科[14]。代谢组学研究过程包括样品制备和代谢产物分离、检测与鉴定以及数据分析与模型建立3个部分。代谢组学关注生物体系受环境刺激或基因修饰所产生的所有代谢产物的变化，并通过分析体液代谢物组成来确定生物体系的系统生化谱和功能调控规律[15]。

生物体细胞内的生命活动离不开物质代谢，代谢是生命活动中所有生物化学变化的总称，代谢活动是生命活动的本质特征和物质基础。代谢组指的是生物体的一个细胞、组织或器官中所有代谢组分的集合，所有对生物机体有影响的因素均可反应在代谢组中，生物体内特定时刻的代谢组最能直接反映该个体特定时刻的生理病理状态，生物体许多不能从基因组、蛋白质组体现出的变化可以通过代谢组体现，基因和蛋白表达的微小变化会在代谢物上得到放大，而基因、蛋白的生命调控效应最终也需落实在代谢层面上，代谢组学是揭示机体生命活动代谢本质的科学，因此代谢组学被认为是 “组学”研究的最终方向[16]。代谢组学跳过生命体内的复杂调控过程，通过对机体代谢物组的分析给出最终的、整体的结果，反映的是基因、药物、食物、环境及时间等各种内外因素综合作用于机体后的总的反应，从系统的角度来解释生命现象，在恶性肿瘤早期诊断方面具有巨大的优势，能提供寻找肿瘤早期诊断相关生物标志物的重要技术平台[17]。

2 代谢组学为肿瘤早期诊断研究提供了新思路

随着人类基因组测序的完成，生命科学进入功能基因组时代[18]。转录组学和蛋白质组学方法在肿瘤生物学领域中的应用取得了一些成功，如新的肿瘤亚型的鉴定、相应基因水平和蛋白水平特定类型肿瘤标志物的鉴定等。但其并不能提供对于疾病生化改变所反映的终点诊断标志物及最终的诊断信息[19]。代谢组学用反映整体的代谢物图直接认识生命体的生理和生化状态，处于基因组和蛋白质组的下游，是基因组和蛋白质组的补充，因此能提供区别于其他 “组学”而来的大量信息，能够更为灵敏地鉴定出基因改变、疾病和环境因素作用所产生的特定代谢型[20]。代谢组学在环境变化对机体产生作用的研究中具有更大的优势。在肿瘤的发生及进展中，肿瘤细胞中的微小变化都会引起代谢物中的 “延增效应”，产生大量的异乎寻常的代谢物[21]，因此用代谢组学进行肿瘤的早期诊断其灵敏性更高。代谢组学在肿瘤早期诊断方面具有独特优势：首先，代谢组学标本易于从临床取材，并能够获得动态观察结果；其次，肿瘤细胞的产生与发展与肿瘤宿主的微环境密切相关，调控肿瘤细胞生长所必须的各种分子代谢物及细胞分裂产物在组织液中的浓度远远大于细胞内。

恶性肿瘤是一种多因素参与、造成机体各系统功能平衡紊乱的复杂疾病，在肿瘤的发生和发展过程中，机体各组分在结构、功能及形态上会产生相互影响、相互作用的紊乱，机体的代谢产物会随之发生相应的动态变化，其中代谢作为功能和形态的基础，是恶性肿瘤发生的重要环节，其代谢作用与正常组织明显不同。已报道的肿瘤特异性代谢产物涵盖各类生物大分子的物质代谢。研究[22]表明：相对于正常细胞，肿瘤细胞出现代谢谱改变、葡萄糖吸收率增高和糖酵解增强，合成DNA聚合酶和RNA聚合酶活性均较正常组织高，蛋白质合成代谢和分解代谢均增强，且合成代谢超过分解代谢，甚至可夺取正常组织的蛋白质分解产物，合成肿瘤本身需要的蛋白质，导致机体处于恶病质状态；肿瘤细胞不仅代谢旺盛，肿瘤的发生和发展也离不开其周围微环境，肿瘤生长赖以生存的周围微环境主要是一些关键代谢物，如葡萄糖、养分和营养性生长因子，呈酸性环境，构成此环境的是乳酸盐等一些小分子；肿瘤细胞周围环境诱导血管内皮细胞生长因子（VEGF）大量表达，VEGF诱发新的微血管形成，为肿瘤带来更多营养，促进其生长。可见，肿瘤发生和发展的早期与代谢网络改变密切相关。机体代谢产物主要存在于唾液、血液和尿液等体液中，对这些液体进行代谢物组成的检测和分析，可能了解恶性肿瘤发生和发展过程中伴随的生物化学变化，并发现恶性肿瘤发生和发展过程中变化的异常代谢组生物标志物，有助于恶性肿瘤的早期诊断。

现有的肿瘤早期诊断相关生物标志物主要以基因表达产物、蛋白类为主，基因组学和蛋白质组学分别从基因和蛋白质层面研究肿瘤的发生机制，而实际上细胞内许多活动均发生在代谢层面。随着组学研究的逐步深入，研究者逐渐认识到：基因组的变化不一定能够得到表达，从而并不对系统产生影响。某些蛋白的浓度会由于外部条件的变化而升高，但由于这个蛋白可能不具备活性，从而也不对系统产生影响。某个基因或蛋白的缺失会由于其他基因或蛋白的存在而得到补偿，最后反应的净结果为零。而小分子的产生和代谢才是这一系列事件的最终结果，其能够更准确地反映生物体系的状态[23]。代谢组学反映的是基因功能活动的终点和生物体的生物化学表型的变化，同时也直接与最终效应相联系。代谢组学所具有的整体性、可定量性和可预测性研究显示出巨大的优势，从机体的动态代谢途径，到恶性肿瘤发生和发展的各阶段均有良好应用前景，尤其在筛选有助于肿瘤早期诊断的生物标志物及肿瘤模式分类和病理分型上有显著优势。

3 代谢组学在肿瘤早期诊断中的应用

3.1 筛选肿瘤相关生物标志物 代谢组学最新技术进展使鉴定多种肿瘤相关分子生物标志物变得更加容易。在肿瘤发生的早期阶段，利用代谢组学技术的定量分析联合先进的统计分析方法，将可能监测特定代谢过程中代谢物的变化或波动情况，有助于促进恶性肿瘤筛查和检测，从而提高恶性肿瘤的早期诊断。如脂质和胆固醇变化谱是细胞膜破坏的标志，这些变化往往表明细胞正在经受各种因素刺激而导致凋亡的过程。Kim等[24]研究指出：利用代谢组学方法可以预测早期肿瘤细胞表型的改变，从而使得在肿瘤细胞表型改变前，即在肿瘤的代谢组发生微小的改变时做出诊断，从而在很大程度上可发现新的早期诊断特征性代谢小分子，作为肿瘤早期诊断的生物标志物。Chen等[25]通过代谢组学发现小分子生物标记物，并在细胞水平上应用酶的抑制和诱导相结合的研究手段发现和证明了下调硬脂酰基－辅酶A脱氢酶是肝炎和急性结肠炎恶化的小分子代谢通路。Yang等[26]采用魔角自转核磁共振分光检定法结合PCA研究人肝癌的特征性代谢模式，结果发现：在肝癌组织中乳酸盐、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、亮氨酸、丙氨酸和磷酸乙醇胺（PE）等代谢产物相对于邻近正常组织明显升高，而甘油三酯、葡萄糖和糖原明显下降，得出的结果再利用PCA进行分析，从而可以成功区分肝癌和正常组织，表明这些代谢小分子簇可作为肝癌早期预后和诊断的生物标志物。Brockmoller等[27]采用代谢组技术，发现乳腺

癌组织中存在着高浓度的磷脂酰胆碱类成分，并与癌细胞增殖成正相关，且进一步对甘油-3-磷酸乙酰转移酶（GPAM））mRNA和蛋白表达的分析，证实GPAM的高表达是磷脂酰胆碱类成分增加的重要因素，也与乳腺癌发病密切相关。Roberts等[28]认为：代谢组学不仅可以有效地诊断前列腺癌，而且可以探测癌前期的变化，真正做到早期预防和诊断前列腺癌的发生，并发现柠檬酸盐、精胺、肌醇、乳酸盐等成分在正常人群和癌症人群中是有差异的。Huang等[29]比较27例膀胱癌患者和32例正常人群的代谢产物，发现肉毒碱C9∶1和组分Ⅰ为膀胱癌的生物标志物，其敏感性和特异性分别达92.6%和96.9%，且2种生物标识物联合诊断较单一生物标志物诊断更具优越性。Tan等[30]利用代谢组学技术，从二乙基亚硝胺诱导的肝癌大鼠模型中发现牛磺胆酸等3个主要的代谢标志物，并且在随后的412份临床样本中也得到了证实，3个代谢标志物的灵敏度和特异性均在80%以上，远远超出了目前临床用α－胎儿球蛋白检测所表现出的60%的水平。

3.2 肿瘤鉴别诊断 代谢组学技术也广泛应用于肿瘤鉴别诊断中。Sreekumar等[31]采用代谢组学技术，检测血液和尿液的代谢谱，成功的区分出良性前列腺、前列腺原位癌和转移癌，并通过进一步的细胞验证试验和氨基酸N-甲基转移酶敲出等研究，证实了肌氨酸合成的增加是前列腺癌发病的重要机制。Fang等[32]应用1H-NMR研究SD大鼠慢性胰腺炎和胰腺癌完整胰腺组织的代谢谱差异，结果与胰腺炎相比，在胰腺癌中磷酸胆碱和甘油磷酸胆碱显著降低，而亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、乳酸盐和丙氨酸呈现出明显升高，同时结合PCA方法成功区分出了胰腺癌和慢性胰腺炎SD大鼠。Gao等[33]采用NMR对63例健康志愿者、39例干细胞癌患者及33例肝硬化患者血清进行分析，再次证明了代谢组学方法良好的区分度。杜振华等[34]利用具有高分辨率和高质量精度的高效液相色谱－轨道离子阱质谱联用系统为分析平台，发现由血清代谢轮廓构建OPLS DA模型可以很好地区分肝硬化的临床分级，成功发现并初步鉴定出区分各个阶段的相应代谢标志物。陈文学等[35]采用高分辨魔角旋转核磁共振氢谱技术结合多维变量分析方法，研究了30例神经上皮肿瘤组织（包括2例低级星形细胞瘤（Ⅰ级）、12例中级星形细胞瘤（Ⅱ级）、8例间变型星形细胞瘤（Ⅲ级）、3例胶质母细胞瘤（Ⅳ级）和5例髓母细胞瘤（Ⅳ级））的代谢特征，并与临床病理结果进行对照，结果发现：神经元（NAA）、肌酸、顺式肌醇、甘氨酸和乳酸等代谢物的浓度以及一些代谢物与肌酸的浓度比值在不同级别的脑肿瘤组织间均具有显著性差别（P＜0.05），这些代谢物的浓度比值主要包括乳酸/肌酸、NAA/肌酸等；采用人为监管模式识别方法建模来区分低、高级肿瘤，准确率达87%，预测高级（Ⅲ和Ⅳ级）肿瘤灵敏性和特异性分别高达87%和93%，高分辨魔角旋转核磁共振氢谱技术结合模式识别方法在不久的将来有可能成为一种潜在、快速、准确的人类脑肿瘤的分级手段。4 展 望

新兴的组学技术正广泛应用于恶性肿瘤生物标志物研究及肿瘤早期鉴别诊断，代谢组学作为系统生物学中一个新的分支，是基因组学、转录组学和蛋白质组学有力的补充，正处于迅速发展的阶段。代谢组学最大的特色在于建立了以整体观来剖析生命现象的理念，从生物代谢层面，以小分子代谢化合物为研究对象，以其独特的视角，从机体的动态代谢途径中寻找出具有特异性诊断价值的肿瘤生物标志物，在恶性肿瘤的早期诊断方面具有很大的发展潜力。代谢组学研究做得最多的是代谢组差异研究，从寻找主要差异入手，结合其他组学信息，阐明基因功能和调控机制。代谢组学的研究已由早期对差异化合物的发现，逐渐延伸到现今对生物标志物的确证、代谢通路的解释和机制的探讨。以多个水平相结合的代谢组学研究方法配合分子生物学的技术手段，实现整体代谢通路与特定代谢途径间互补与统一的研究策略，已成为当今代谢组学的发展方向。代谢组这种高通量的手段，全方位的展示了肿瘤机体小分子代谢物群的全貌，将已被证实、有待研究及与机制相关的多种生物标志物同时显示在一张色谱图上，充分表明肿瘤代谢组学研究将有助于深入理解肿瘤发生和发展的病理分子机制，必将在肿瘤的早期诊断中发挥更大的作用。

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