蛋白激酶Wee1B在小鼠1-细胞期受精卵中的表达及其定位

刘 超，肖建英，任丽莉，刘 洋，马浚仁，于秉治

(1.中国医科大学生物化学与分子生物学教研室，辽宁 沈阳 110001；2.辽宁医学院发育生物学教研室， 辽宁 锦州 121001；3.辽宁医学院生物化学与分子生物学教研室，辽宁 锦州 121001)

蛋白激酶Wee1B在小鼠1-细胞期受精卵中的表达及其定位

刘 超1,2，肖建英3，任丽莉3，刘 洋3，马浚仁3，于秉治1

(1.中国医科大学生物化学与分子生物学教研室，辽宁 沈阳 110001；2.辽宁医学院发育生物学教研室， 辽宁 锦州 121001；3.辽宁医学院生物化学与分子生物学教研室，辽宁 锦州 121001)

目的：检测小鼠1-细胞期受精卵各个细胞周期中蛋白激酶Wee1B的表达水平及其定位水平，初步阐明Wee1B对哺乳动物受精卵早期发育调控的机制。方法：超排卵获得小鼠1-细胞期受精卵，收集卵细胞后用RT-PCR和Western blotting方法检测Wee1B的mRNA和蛋白表达水平；放射自显影测定Wee1B活性；间接免疫荧光观察Wee1B在各个细胞时期的定位。结果：小鼠1-细胞期受精卵G1、S、G2和M期Wee1B mRNA相对表达量比较差异均无统计学意义(Pgt;0.05)；S、G2和M期Wee1B蛋白表达量与G1期比较差异有统计学意义(Plt;0.01)；与G1期比较，S、G2期Wee1B活性逐渐增高(Pgt;0.05，Plt;0.01)， M期Wee1B活性迅速下降(Plt;0.01)。G1期和S期细胞Wee1B蛋白偶联的红色荧光信号主要集中分布于细胞核，但在G2期细胞红色荧光信号弥散分布于细胞浆，在M末期和2-细胞期可见红色荧光信号又重新分布于细胞核，细胞浆内荧光减弱。结论：蛋白激酶Wee1B在小鼠1-细胞期受精卵各个细胞周期动态表达，Wee1B蛋白存在核浆转位，Wee1B的定位变化可能调控小鼠受精卵有丝分裂。

Wee1B；Wee1蛋白；小鼠；合子；蛋白表达；蛋白定位

细胞分裂周期2(cell division cycle 2，Cdc2)/细胞周期蛋白B(cyclinB)复合物又称为成熟促进因子(maturation promoting factor，MPF)，是减数和有丝分裂细胞周期中关键的调节因子，并被认为是在细胞周期不同调控途径中整合信号的中心枢纽[1]。在高等真核生物中MPF活性的调节主要通过形成由Cdc2催化亚基和Cyclin B调节亚基组成的复合物，进而通过磷酸化/去磷酸化Cdc2上的Thr14 和 Tyr15来发挥作用。在细胞分裂间期，直到G2期结束时，Wee1蛋白激酶家族磷酸化Cdc2上的Thr14 和 Tyr15残基使MPF处于失活状态。进入M期时，Cdc25蛋白磷酸酶使Cdc2上述2个关键位点去磷酸进而被激活。MPF在G2期末活性达到高峰，从而促进细胞进入M期，细胞开始分裂。一旦开始激活，MPF通过Wee1和Cdc25形成的反馈环被进一步激活[2]，因此Wee1和Cdc25的调节对G2/M期转换至关重要。

哺乳动物的Wee1激酶家族包括Weel[3-4]和Myt1激酶[5]，这个家族通过磷酸化失活与细胞周期蛋白依赖激酶(Cyclin dependent kinase，CDK)来负调控细胞周期进程。目前为止，人们已经从哺乳动物中相继鉴定出3种相关的Wee1基因产物，包括Wee1A、Wee1B和Myt1。Wee1能磷酸化Ser、Thr和Tyr的残基，是双特异性蛋白激酶。Wee1缺失可使细胞有丝分裂提前成熟，导致体积变小，因此命名为Wee的亚型。Wee1A激酶在细胞核中通过磷酸化Tyr15来抑制Cdc2激酶的活性[6]。相反，Wee1家族的另一个成员，Myt1结合Cdc2/Cyclin B复合体，将其定位在细胞质，并磷酸化其Thr14/Tyr15，Myt1优先磷酸化Thr14，作为一个膜结合激酶来抑制G2/M的进程[7]，因此Wee1被认为是主要负责Tyr15磷酸化的蛋白激酶。然而，在人[8]、小鼠[9]、猪[10]和恒河猴[11]的卵母细胞中，第2个Wee1基因，即Wee1B存在于胚胎细胞中，其作用与Wee1A相似，在细胞核中通过磷酸化Tyr15来抑制Cdc2激酶的活性，在减数分裂停滞过程中发挥着重要的作用。但是国内外有关Wee1B在哺乳动物受精卵早期发育过程中作用鲜有报道。本实验以小鼠1-细胞期受精卵为模型，对受精卵各个细胞周期中Wee1B的表达及其定位进行初步观察，为进一步阐明Wee1B对哺乳动物受精卵早期发育调控机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试剂和主要仪器 M2和M16培养液 (Sigma公司，美国)；RNA PCR Kit (AMV)Ver. 3.0试剂盒 (Takara 公司，日本)；快速微量mRNA提取纯化试剂盒(GE Healthcare UK公司，英国)；Wee1B(兔抗小鼠多克隆抗体，Signalway antibody公司，美国)、β-actin抗体(兔抗小鼠多克隆抗体，Santa Cruz公司，美国)；HRP标记的山羊抗兔IgG (北京中杉金桥生物技术有限公司,中国)；Western细胞裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒、Hoechest33258、TRITC标记的山羊抗兔IgG (北京碧云天生物技术公司)；ECL化学发光试剂盒(Piece Biotechnology公司，美国)；[γ-32P](北京福瑞生物工程公司，中国)；孕马血清促性腺激素(pregnant mare’s serum gonadotropin，PMSG，天津华孚高新技术生物公司，中国)；人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，hCG，上海生物胜华制药，中国)；其余试剂(Sigma公司，美国)。BB16UV CO2培养箱(Heraeus公司，德国)；显微操作系统(Olympus IX-70倒置显微镜、DIC 调制相差观察、Nari-shihgeON2显微操作系统、注射针制作装置、JVC/Sony视频记录仪器等，日本)。水浴式电转印槽DYY-Ⅲ 40B型(北京六一仪器厂，中国)；凝胶自动成像仪 GDS8000、电泳仪及电泳槽(Bio-Rad公司，美国)；LS3801液闪计数仪(Beckman公司，美国)；相差显微镜OPTIPHOT/DIC型(Nikon公司，日本)；实体显微镜SZ12型(Olympus公司，日本);激光共聚焦扫描显微镜(Leica公司，德国)；紫外分光光度仪(PYE-UNICAMSPECTRONIC公司，美国)。

1.2 小鼠超排卵及受精卵的采集和培养 根据Xiao等[12]的方法进行小鼠超排卵和受精卵的收集及培养。取4～5周龄昆明系雌性小白鼠，腹腔注射PMSG 10 IU/只；PMSG注射后48 h腹腔注射hCG 10 IU/只，注射hCG后当晚与雄鼠1∶1合笼。次日晨检查雌鼠阴栓，有阴栓者视为交配成功。脱颈法处死雌鼠，取双侧输卵管，剪下末端膨大置于M2培养液中，在实体显微镜下撕开壶腹部，让受精卵细胞流出，透明质酸酶(300 mg·L-1) 除颗粒细胞，反复清洗受精卵后放入M16培养液中培养至指定时间进行收集，冻存于-70℃。

1.3 RT-PCR方法检测Wee1B的mRNA表达 将收集到的每组100个受精卵按EllustraTMQuickPrep Micro mRNA Purification试剂盒操作步骤提取RNA,主要包括：样品的提取，mRNA的分离，分别用高盐缓冲液和低盐缓冲液对已结合mRNA的Oligo (dT)纤维颗粒的洗涤，mRNA的洗脱。1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，于核酸蛋白测定仪测定RNA浓度，当A260/A280比值达1.9～2.0时可用于逆转录反应。用Takara RNA PCR(AMV)Ver 3.0试剂盒，按操作步骤进行反转录和PCR。反转录条件：42℃、30 min，99℃、5 min，5℃、5 min。PCR引物序列：mWee1B (NM_201370.2) 5′-CGCAAAGGGAA-CTTTCCAGAG-3′ 和5′-TGTAGCAAAAGGCCAGAAGTG-3′，预计产物长度380 bp；PCR反应体系为25 μL，反应条件：预变性95℃、2 min，变性95℃、30 s，退火60℃、30 s，延伸72℃、30 s，终延伸72℃、10 min，反应共35个循环。以β-actin (NM_007393)作为内对照，引物为：5′-TGACGGGGTCACCAACTGTGCCCATCT-3′和5′-AGAATGTAGTCCGCCAGGTC-3′，预计产物长度为661 bp，反应产物经1%琼脂糖凝胶电泳后成像。

1.4 Western blotting方法检测Wee1B蛋白表达 按需要定时收集G1、S、G2和M期受精卵各160个，3 000 r·min-1、4℃离心5 min，弃上清，加入20 μL蛋白提取缓冲液(20 mmo1·L-1Tris-HCl，pH7.5， 2 mmol·L-1EDTA，10 mmol·L-1EGTA，0.25 mmo1·L-1Glucose)，室温和-70℃反复冻融裂解3次，加入5×SDS样品缓冲液，100℃煮沸5 min，12 000 r·min-1瞬时离心后上样。12% SDS-PAGE电泳分离，将蛋白转至PVDF膜上，用含3%BSA的TBST(pH7.4)室温孵育PVDF膜2 h，封闭后的滤膜分别与Wee1B抗体(稀释比为1∶1 000)、β-actin(稀释比为1∶1 000) 4℃温育过夜。经TBST洗膜 3次后，辣根过氧化物酶(HRP)偶联的山羊抗兔IgG作为二抗(1∶5 000)室温摇动温育2 h，TBST洗膜后，ECL化学发光法显影成像。

1.5 放射自显影方法检测Wee1B活性 按照Oh等[13]方法进行Wee1B活性测定。小鼠1-细胞期各期受精卵各10个，3 000 r·min-1离心4 min，弃去上清，加入5 μL的裂解缓冲液充分振荡混匀，12 000 r·min-1离心15 min。通过免疫沉淀法获得目的蛋白后，加入5 μL的激酶反应液和500 μCi·mL-1[γ-32P] ATP 后开始反应。样品在30℃水浴反应30 min，产物加入10 μL 2×SDS上样缓冲液，煮沸以终止反应，取10 μL点在Whatman P81强阳离子交换滤纸上，以75 mmol·L-1磷酸溶液终止反应后，滤纸置于液闪瓶内，Beckman 液闪计数仪测定每分钟放射活性(cpm值)。

1.6 间接免疫荧光实验观察内源性Wee1B蛋白的亚细胞定位 分别取G1、S、G2和M期受精卵放入4%多聚甲醛溶液室温固定40 min，PBST洗涤3次，含0.1% Triton-X 100 的PBS打孔30 min，3%BSA室温封闭1～2 h，将卵细胞转入Wee1B一抗中4℃孵育过夜，次日用PBS缓冲液洗涤3次以去除未结合的一抗，加入TRITC标记的山羊抗兔IgG，37℃孵育30 min。PBS缓冲液洗涤3次，加入Hoechst33258荧光染料室温、避光孵育3～5 min，使核酸着色，在激发光为488和260 nm的激光共聚焦显微镜下观察Wee1B蛋白在受精卵中的定位并照相。每组实验重复2～4次。

2 结 果

2.1 小鼠1-细胞期受精卵形态 根据注射hCG后时间及相差显微镜下观察的细胞形态分别收集G1、S、G2和M期受精卵。注射hCG 19 h后收集G1期(注射hCG后13～21 h)受精卵，可见在卵细胞中雌雄原核相距较远，雌原核略小于雄原核；注射hCG 22 h后收集S期 (注射hCG后21～27 h)受精卵，可见雌雄原核体积增大并相互靠近，出现可见的核仁；注射hCG 28 h后收集G2期(注射hCG后27～30 h) 受精卵，此时雌雄原核的轮廓已经消失，胞浆呈粗大的颗粒状，细胞边缘开始出现波动变化；注射hCG 31 h后收集M期 (注射hCG后30～33 h)受精卵，此时受精卵胞体已经拉长，胞质分裂及染色体分散到两极(图1，见插页一)。

2.2 小鼠1-细胞期受精卵中Wee1B mRNA表达水平 RT-PCR结果显示：Wee1B在受精卵各个时期均有表达，且G1、S、G2和M期mRNA的相对表达量分别为0.532±0.005、0.529±0.002、0.553±0.006和0.548±0.005，各期间mRNA的相对表达量比较差异均无统计学意义(Pgt;0.05)。见图2。

图2 小鼠1-细胞期受精卵中4个时期Wee1B mRNA表达电泳图

Fig.2 Expression levels of Wee1B mRNA at four phases of mouse one-cell-stage embryos

M: Marker DL 2 000;Lane 1: G1phase;Lane 2: S phase;Lane 3: G2phase;Lane 4: M phase.

2.3 小鼠1-细胞期受精卵Wee1B蛋白表达水平 Western blotting法检测结果显示：受精卵G1期Wee1B蛋白开始表达(0.432±0.008)，S期表达增加(1.132±0.015)，高表达持续至G2期(1.069±0.011)，M期蛋白表达减少(0.535±0.005。WeelB蛋白表达水平S、G2和M期与G1期比较差异均有统计学意义(Plt;0.01) (图3)。

图3 小鼠1-细胞期受精卵中Wee1B蛋白表达电泳图

Fig.3 Expression levels of Wee1B protein in mouse one-cell-stage embryos

Lane 1: G1phase;Lane 2: S phase;Lane 3: G2phase;Lane 4: M phase.

2.4 小鼠1-细胞期受精卵Wee1B活性 以组蛋白[typeⅢ-S]为底物，激酶活性测定结果显示：Wee1B活性随着细胞周期的进程而变化，在G1期其活性保持平稳(4 084.0±235.9)，与G1期比较，当进入S期(4 132.0±412.0,Pgt;0.05)和G2期(4 332.6±319.2,Plt;0.01)后Wee1B的活性逐渐增高，随后在M期活性迅速下降(2 118.0±274.0,Plt;0.01)。

2.5 小鼠1-细胞期受精卵细胞免疫荧光定位 间接免疫荧光实验结果显示： G1期和S期细胞Wee1B蛋白偶联的红色荧光信号主要集中分布于细胞核，在G2期细胞红色荧光信号弥散分布于细胞浆，在M末期至2-细胞期可见红色荧光信号又重新分布于细胞核，细胞浆内荧光减弱(图4，见插页一)。

图5 小鼠Wee1B蛋白NLS和NES结构预测

Fig.5 Predication of NLS and NES structures of Wee1B protein in mice

3 讨 论

自Nakanishi等报道第1个人母源性Wee1B基因以来[14]，最近才相继在不同物种中证实了Wee1B在小鼠、猪和恒河猴卵母细胞中的存在[9-11,15-16]，而Wee1B在小鼠受精卵早期发育过程中的表达及定位尚未见报道。本实验用RT-PCR和Western blotting方法检测Wee1B在小鼠1-细胞期受精卵中各个不同时期mRNA和蛋白表达结果表明:Wee1B mRNA在受精后各个时期均有表达，且各组比较差异无统计学意义；Wee1B蛋白在G1期开始表达，S期和G2期表达增加，M期蛋白表达减少。Wee1B蛋白表达和mRNA表达水平在M期不一致，可能与Wee1B的翻译后修饰有关[9]。Wee1B蛋白在M 期表达减少，表明Wee1B负调控可能是Cdc2/cyclinB活化进而促进G2/ M期转换机制的一部分。本研究结果表明：Wee1B的蛋白水平变化与从爪蟾卵细胞提取物取得的研究结果相一致[3]，而M期Wee1B蛋白表达减少可能与泛素依赖的蛋白酶体降解有关。但Han[16]等发现：小鼠Wee1B蛋白在爪蟾卵母细胞前期至中期转换过程中水平不变，说明Wee1B的失活与蛋白降解无关，这也提示Wee1B表达具有时间和空间特异性，其具体的机制也是本课题组进一步研究的方向之一。

由于蛋白定位与其功能有密切关联，本课题组利用间接免疫荧光方法检测Wee1B蛋白在小鼠1-细胞期胚胎中的定位对小鼠受精卵发育的影响，结果提示：1-细胞期受精卵从G2期向M期的转换过程中发生了Wee1B向细胞浆的转位，在2-细胞初期，部分Wee1B蛋白又从细胞浆回到细胞核。1-细胞期受精卵不同时期的Wee1B蛋白定位发生变化，提示一定有某种机制能够解释核浆转位。核定位序列(nuclear location signal，NLS)和核输出序列(nuclear export signal，NES)经常介导蛋白在细胞核和细胞浆之间的穿梭[16]。为进一步明确Wee1B蛋白是否存在某些结构域与该蛋白的细胞定位有关，本研究应用Psort Ⅱ和Target P软件对Wee1B蛋白的氨基酸序列分析。结果提示：在小鼠Wee1B蛋白的NLS位于N末端调节域的162～176位氨基酸(LQSKGKRKTRDYLEE)，而NES是一段位于催化结构域内310～334位点(KLKDILLQISLGLKY)富含Leu等疏水氨基酸残基的模体(图5)。NES不仅可能介导Wee1B蛋白的核输出，还可能通过掩盖Wee1B蛋白的催化结构域进而调节激酶的活性。Oh等[13]通过突变NLS和NES证实NLS和NES是核浆穿梭的结构基础，为调控小鼠卵母细胞减数分裂过程所必需。然而，Wee1B在受精卵细胞内不同时期的定位变化是否依赖于NLS和NES，Wee1B如何实现核内外穿梭平衡来调控MPF活性进而调控小鼠受精卵有丝分裂，也是本课题组进一步研究的方向之一。

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ExpressionandlocalizationofproteinkinaseWee1Binmouseone-cell-stageembryos

LIU Chao1,2,XIAO Jian-ying3,REN Li-li3,LIU Yang3,MA Jun-ren3,YU Bing-zhi1

(1.Department of Biochemisty and Molecular Biology,China Medical University,Shenyang 110001,China; 2.Department of Developmental Biology,Liaoning Medical University,Jinzhou 121001,China; 3.Department of Biochemisty and Molecular Biology,Liaoning Medical University,Jinzhou 121001,China)

ObjectiveTo observe the expression and localization of protein kinase Wee1B in mouse one-cell-stage embryos, and to pay foundation for further study on the mechanism of the early development of mouse embryos.MethodsOne-cell-stage mouse embryos were collected after superovulation,and the mRNA and protein expression levels of Wee1B were examined by RT-PCR and Western blotting,respectively.The Wee1B activity in mouse embryos was detected by autoradiography and the localization of Wee1B in each cell cycle was observed by indirect immunofluorescence.ResultsThere were no significant differences in the expression levels of Wee1B mRNA between G1, S, G2and M phases (Pgt;0.05); but there were significant differences in the expression levels of Wee1B protein between S, G2, M phases and G1phase (Plt;0.01).Compared with G1phase, the activities of Wee1B in G2phase and S phase were increased (Pgt;0.05，Plt;0.01)，but the activity of Wee1B in M phase was decreased (Plt;0.01). Wee1B distributed in the nucleus at the G1and S phases and translocated to the cytoplasm at the G2/M transition in one-cell-stage embryos.ConclusionThe protein and activity of Wee1B are dynamically expressed in one-cell-stage embryos and the nucleocytoplasmic shuttling of Wee1B may be the mechanism of early development of mouse embryos.

Wee1B；Wee1 protein；mouse zygote；protein expression;protein localization

1671-587Ⅹ(2013)05-0863-05

10.7694/jldxyxb20130501

2013-04-09

国家自然科学基金资助课题(81270654，81270698)；辽宁省教育厅科研基金资助课题(L2012303)

刘 超(1978-)，女，辽宁省铁岭市人，副教授，医学博士，主要从事分子生殖和分子肿瘤学的研究。

于秉治(Tel:024-23261253，E-mail:ybzbiochem@yeah.net)

时间: 2013-08-23 08:18

网络出版地址: http://www.cnki.net/kcms/detail/22.1342.R.20130823.0818.001.html

Q132

A