姜黄素对铁负载小鼠脑组织caspase-3、caspase-9和livin蛋白表达的影响及其对神经系统的保护作用

于 嵩，胡江平

(1.辽宁中医药大学基础医学院解剖组胚教研室，辽宁 沈阳 110847； 2.牡丹江医学院组织胚胎学教研室，黑龙江 牡丹江 157000)

姜黄素对铁负载小鼠脑组织caspase-3、caspase-9和livin蛋白表达的影响及其对神经系统的保护作用

于 嵩1，胡江平2

(1.辽宁中医药大学基础医学院解剖组胚教研室，辽宁 沈阳 110847； 2.牡丹江医学院组织胚胎学教研室，黑龙江 牡丹江 157000)

目的：观察姜黄素对小鼠脑组织铁负载后caspase-3、caspase-9和livin蛋白表达的影响，探讨其对铁离子所诱导的中枢神经系统毒性作用的保护机制。方法：将30只CD1小鼠按双盲法随机分为生理盐水对照组、FeCl3组和姜黄素干预组，每组10只。3组小鼠脑组织分别行尼氏染色观察海马神经元形态，免疫组织化学染色和Western blotting法检测小鼠脑组织caspase-3、caspase-9和livin蛋白表达强度和水平。结果：尼氏染色结果，与对照组比较，FeCl3组小鼠海马出现神经元丢失，明显细胞核浓缩和细胞核裂解消失现象；姜黄素干预组小鼠海马神经元萎缩和核裂解消失现象减少。免疫组织化学染色及Western blotting检测结果，与对照组比较，FeCl3组小鼠脑组织caspase-3、caspase-9蛋白表达水平明显升高，livin蛋白表达水平降低(Plt;0.05)；姜黄素干预组小鼠脑组织，caspase-3和caspase-9蛋白表达水平降低，livin蛋白表达水平增强(Plt;0.05)。结论：姜黄素对铁离子所致小鼠神经元毒性具有明显抑制作用，其可能机制是抑制了凋亡通路中的caspase-3和caspase-9蛋白，同时激活了凋亡抑制因子livin蛋白。

姜黄素；铁离子；神经细胞；毒性作用

研究[1-3]表明：铁的异常增高会对神经细胞产生毒性作用，多种神经退行性疾病都与铁的异常增高有关系，如阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)、帕金森病(Parkinson’s disease，PD)和脑出血继发性脑损伤等。姜黄素(curcumin)作为常用传统中药，已经开始用于多种神经退行性疾病的治疗，如PD和AD，并取得一定疗效，但目前尚无姜黄素治疗PD和AD等神经退行性疾病与抗铁离子的神经毒性有关的报道。本实验通过将FeCl3直接注入小鼠脑脊液中，然后给予姜黄素干预，观察姜黄素对小鼠脑组织caspase-3、caspase-9和livin蛋白表达水平的影响，以探讨姜黄素对铁离子诱导的脑损伤的保护作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物和分组 3月龄健康CD1小鼠， 雌雄不限，体质量22～25 g，共30只，由中国医科大学实验动物中心提供动物，合格证号SYXK(辽)2008-0005。将受试小鼠随机分为3组，每组10只。生理盐水对照组：将3 μL生理盐水立体定向注入该组小鼠右侧侧脑室；FeCl3组：将3 μL FeCl3·6H2O 溶液(40 mmol·L-1)立体定向注入小鼠右侧侧脑室；姜黄素干预组：小鼠右侧侧脑室注射3 μL FeCl3·6H2O溶液后1 h腹腔注射姜黄素50 mg·kg-1·d-1，连续3 d。所有小鼠均于注射术后第7 天时处死。模型成功标准：小鼠脑室注射FeCl3后出现追尾现象视为模型制备成功。排除造模失败小鼠。本实验小鼠模型成功18只，失败2只。生理盐水对照组10只， FeCl3组9只，姜黄素干预组9只。

1.2 侧脑室立体定向注射 10%水合氯醛溶液(350 mg·kg-1) 腹腔注射麻醉小鼠，固定于立体定位仪上，前端套齿，两侧耳杆固定头部。颅顶部正中切开皮肤，3% H2O2溶解骨膜，使前囱暴露清晰，根据 《小鼠脑图谱》，选择右侧侧脑室作为注射点 (坐标为前囱后1.0 mm，中缝向右旁开1.5 mm，硬膜下2.5 mm) ，牙钻钝性钻开颅骨相应部位，用5 μL 微量注射器经钻孔垂直进针达坐标点处，分别注射上述相应溶液3 μL，注药速度为1 μL·min-1，注射后留针5 min，缓慢拔针，消毒后缝合皮肤，放回笼中喂养。

1.3 脑组织标本处理 各组小鼠断头处死，其中5只小鼠迅速取出大脑，放入4%多聚甲醛中固定，常规制备石蜡切片，用于免疫组织化学染色；另5只小鼠迅速取出大脑，仔细分离出海马，-80℃保存，用于Western blotting检测。

1.4 尼氏染色 小鼠脑组织石蜡切片经二甲苯脱蜡梯度脱水至第2次100%酒精内脱水2 h，焦油紫工作液内37℃持续60 min，95%酒精中快速分化，无水酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。光学显微镜(使用10倍和40倍物镜)观察形态学变化并采集图像。

1.5 免疫组织化学染色 小鼠脑组织石蜡切片经二甲苯脱蜡，0.01 mol·L-1PBS冲洗，微波煮沸修复抗原，自然冷却，PBS冲洗。5%山羊血清室温孵育1 h，一抗(兔抗小鼠caspase-3、caspase-9和livin)4℃孵育过夜，PBS充分漂洗，生物素-山羊抗兔IgG室温孵育2 h，0.05 mol·L-1Tris-HCl充分漂洗，链霉素抗生物素蛋白-过氧化酶室温孵育1 h，DAB显色10 min，蒸馏水冲洗终止反应，苏木素复染，常规脱水、透明和封片，光学显微镜(使用10倍和40倍物镜)观察形态学变化并采集图像。

1.6 Western blotting 检测 称取小鼠大脑海马质量，小剪刀剪碎样品 (冰上操作) ，按1∶ 5比例加入蛋白裂解液，超声粉碎，4℃裂解过夜，4℃、12 000 r·min-1低温离心30 min，取上清，考马斯亮蓝法进行蛋白定量，每管50 μg蛋白分装，-80℃冻存待用。10%分离胶，5%浓缩胶，按照蛋白 (50 μg)10 μL上样，总体积加样后进行电泳，待溴酚蓝降至凝胶的底部时停止电泳；PVDF膜 50 V转膜2 h；5%脱脂奶粉溶液室温封闭2 h；一抗(兔抗小鼠caspase-3、caspase-9和livin)室温孵育2 h；辣根过氧化物酶 (HRP) 标记的山羊抗兔二抗室温孵育1 h；ECL发光；RAD凝胶电泳图像分析仪采集图像，Quantity One软件包对条带进行光密度分析。

2 结 果

2.1 尼氏染色结果 尼氏染色(焦油紫)后的小鼠海马神经元光镜下表现：对照组小鼠海马各区大部分神经元形态正常，见圆形淡染的细胞核(图1A，见插页一)；FeCl3组小鼠海马CA1和CA2区出现神经元明显丢失的情况，可见细胞萎缩和细胞核裂解消失现象，其中CA1区最为明显(图1B，见插页一)；姜黄素干预组小鼠海马神经元萎缩和核裂解消失现象减少，CA1和CA2区神经元数量明显多于FeCl3组(图1C，见插页一)。

2.2 免疫组织化学染色结果 对照组小鼠海马神经元胞质中可见微弱的caspase-3和caspase-9蛋白阳性表达，但可见明显的黄褐色的livin蛋白阳性表达；FeCl3组小鼠海马神经元中黄褐色的caspase-3和caspase-9蛋白阳性表达强度明显高于对照组，livin蛋白表达强度明显低于正常对照组；姜黄素干预组小鼠海马caspase-3和caspase-9蛋白表达强度则低于FeCl3组，livin蛋白表达强度明显高于FeCl3组。见图2(插页一)和图3(插页二)。

2.3 Western blotting法检测结果 Western blotting法检测结果显示：FeCl3组小鼠海马caspase-3和caspase-9蛋白表达量较对照组增加(Plt;0.01,Plt;0.05)，livin蛋白表达量则低于正常对照组(Plt;0.01)。姜黄素干预组小鼠海马caspase-3和caspase-9蛋白表达量明显低于FeCl3组(Plt;0.05)，livin蛋白表达量明显高于FeCl3组(Plt;0.05)。见图3及表1。

图3 各组小鼠大脑海马组织中caspase-3、caspase-9和livin蛋白表达电泳图

Fig.3 Electrophoregram of expressions of caspase-3,caspase-9 and livin proteins of mice in various groups

Lane 1,2:Control group;Lane 3,4:FeCl3group;Lane 5,6:Curcumin intervention group.

表1 各组小鼠大脑海马组织中caspase-3、caspase-9和livin蛋白表达量

GroupnCaspase⁃3Caspase⁃9LivinControl100．180±0．0090．160±0．0120．320±0．025FeCl390．570±0．032∗∗0．250±0．029∗0．150±0．018∗∗Curcumin90．310±0．024△0．170±0．021△0．240±0．036△

*Plt;0.05,**Plt;0.01vscontrol group;△Plt;0.05vsFeCl3group.

3 讨 论

铁是血红蛋白的降解产物之一，生理状态下铁在脑内分布广泛，在脑内氧的运输、电子传递、神经递质和髓鞘合成等功能活动中起重要作用。铁平衡紊乱，尤其铁的过量蓄积可触发一系列病理反应，导致神经元死亡以及多种中枢神经系统疾病。Agrawal 等[4]研究证实：在头颅外伤或脑皮质梗死并发出血后，含铁血黄素沉积于神经组织中，被释放出的铁离子与过氧化氢反应所产生的大量羟自由基氧化双层脂膜从而破坏细胞膜，最终导致神经元死亡。Mastroberardino 等[5]对鱼藤酮致PD模型大鼠脑切片行普鲁士蓝铁染色发现:黑质区多巴胺能神经元内有铁离子沉积，并且铁离子染色阳性的神经元形态学上出现退行性改变(空泡样改变或皱缩)。上述结果均间接地证实了铁离子可以破坏神经元。有学者在离体实验中也证实FeCl3可使培养的神经元发生凋亡[6]。

细胞凋亡又称细胞程序性死亡，是一种有别于坏死的细胞死亡形式。经典的细胞凋亡途径分为线粒体途径和细胞外途径。线粒体途径是当凋亡刺激因子引起细胞色素C释放，与凋亡蛋白激活因子1梭基端的一段基因重复序列结合，形成多聚复合物，与多聚复合物结合胞质中的caspase-9前体形成巨大复合物，导致caspase-9活化，后者再活化下游的caspase-3，被活化的caspase-3再引发级联反应，最终导致细胞凋亡[7]。livin是一类分子水平的抗细胞凋亡调节因子，能够钝化宿主对感染的自杀反应[8]。在正常组织中livin的表达见于心脏、脾脏、卵巢、肺脏、脑、骨骼肌和淋巴细胞，但含量很低。研究[9]表明:livin能直接抑制caspase-3、caspase-7和caspase-9酶水解作用。抑制caspases活性的作用是由BIR结构域来完成的，可能阻止caspase蛋白在细胞凋亡时执行蛋白切除功能。为了验证铁离子的神经元损伤作用以及姜黄素的脑保护作用及其机制，本研究首先应用尼氏染色证实了铁离子可以使小鼠海马CA1和CA2区神经元发生明显损伤坏死，而姜黄素干预的小鼠海马神经元损伤情况明显轻于FeCl3组，神经元数量也明显增多；应用免疫组织化学和Westem blotting检测技术检测3组小鼠海马ccaspase-3、caspase-9和livin蛋白表达情况，结果表明：FeCl3组小鼠脑组织中caspase-3和caspase-9蛋白表达量较对照组明显升高，livin蛋白的表达量则降低，而与FeCl3组比较姜黄素干预组小鼠脑组织则出现凋亡因子caspase-3和caspase-9蛋白表达量降低，livin蛋白表达量增多。本文作者推测：姜黄素通过抑制凋亡因子caspase-3和caspase-9表达，促进凋亡抑制因子livin蛋白表达，起到保护铁离子诱导的神经元毒性作用。

综上所述，侧脑室注射铁离子可以使海马神经元变性坏死，caspase-3和caspase-9表达明显增高，livin表达降低。本研究结果为铁离子参与线粒体凋亡途径提供了直接的证据。同时证实中药成分姜黄素具有保护铁离子诱导脑损伤的作用，为一些与铁离子紊乱相关的神经系统疾病(如AD、PD、癫痫和不宁腿综合征等[6,10-12]) 的治疗提供了新思路。

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Influenceofcurcuminincaspase-3,9andlivinexpressionsinbraintissueofironloadmiceanditsprotectiveeffectonnervoussystem

YU Song1，HU Jiang-ping2

(1.Department of Anatomy and Histology and Embryology,Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Shenyang 110847,China;2.Department of Histology and Embryology, Mudanjiang Medical College,Mudanjiang 157000，China)

ObjectiveTo investigate the influence of curcumin in caspase-3,9 and livin expressions in brain tissue of iron load mice ,and to exlore the protection mechanisms of curcumin on iron ion-induced toxic effects of central nervous system.MethodsAccording to the double blind method,CD1 mice were randomly divided into control group,FeCl3group and curcumin intervention group (n=10).The mouse brain tissues in three groups were conducted with Nissl staining and immunohistochemical staining, and the expressions of caspase-3,caspase-9 and livin were detected with Western blotting method.ResultsThe Nissl staining results showed that compared with control group,the neurons of the mice in FeCl3group were lost and existed nuclear condensation and fragmentation in hippocampus,but they were weaken after injection with curcumin.Compared with control group,the expression levels of caspase-3 and caspase-9 protein in brain tissue of mice were significantly increased and the expression levels of livin protein was decreased in FeCl3group(Plt;0.05).Compared with FeCl3group,the expression levels of caspase-3 and caspase-9 protein were reduced and the livin protein expression level was increased in curcumin group(Plt;0.05).ConclusionCurcumin can significantly inhibit the neurotoxicity of iron ions,the mechanism may be related to inhibiting caspase-3 and caspase-9 in the apoptosis pathway and activating the apoptosis-inhibited factor livin expression.

curcumin;iron ion;nerve cell;toxic actions

1671-587Ⅹ(2013)05-0868-04

10.7694/jldxyxb20130502

2013-04-09

国家自然科学基金资助课题(81203004)

于 嵩(1979-)，女，黑龙江省五常市人，讲师，医学博士，主要从事中药成分对神经退行性疾病的治疗作用及其机制的研究。

于 嵩(Tel：024-31207087，E-mail：yuso1979@yahoo.com.cn)

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