人宫颈癌HeLa细胞氧化损伤中溶酶体与线粒体损伤的时间顺序及其意义

于春艳，刘 希，于春荣，张 钰，苏 静，刘玉和

(1.北华大学基础医学院病理学教研室，吉林 吉林132013；2. 北华大学化学与生物学院实验中心，吉林 吉林 132013；3.北京昭衍新药研究中心有限公司毒理部，北京 100176；4.吉林大学白求恩医学院病理 生理学教研室，吉林 长春 130021)

人宫颈癌HeLa细胞氧化损伤中溶酶体与线粒体损伤的时间顺序及其意义

于春艳1，刘 希2，于春荣3，张 钰4，苏 静4，刘玉和1

(1.北华大学基础医学院病理学教研室，吉林 吉林132013；2. 北华大学化学与生物学院实验中心，吉林 吉林 132013；3.北京昭衍新药研究中心有限公司毒理部，北京 100176；4.吉林大学白求恩医学院病理 生理学教研室，吉林 长春 130021)

目的: 探讨溶酶体及线粒体死亡途径在氧化应激诱导HeLa细胞凋亡过程中的时间顺序及其意义，阐明溶酶体膜通透性在氧化应激诱导线粒体凋亡过程中的重要作用。方法：以对数生长期人宫颈癌HeLa细胞作为研究对象，利用维生素K3(VK3)复制氧化应激模型，实验分为对照组、VK3 1 h、VK3 3 h、VK3 6 h和VK3 12 h作用组。MTT 法检测各组细胞生存率；2′，7′-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)染色检测细胞内活性氧(ROS)水平，吖啶橙(AO)染色观察溶酶体膜通透性，罗丹明123染色检测线粒体膜电势(ΔΨm)，Western blotting法检测凋亡相关蛋白caspase-3活化片段的表达。结果：与对照组比较，VK3 6和12 h组HeLa细胞生存率降低(Plt;0.05)。Western blotting法检测，与对照组比较，VK3 6和12 h组HeLa细胞内caspase-3活化片段表达水平增加(Plt;0.05)。DCFH-DA染色，VK3作用1、3及6 h，HeLa细胞内绿色荧光增强。AO染色，VK3 3 h 和6 h组可见HeLa细胞的溶酶体内红色颗粒状荧光减弱，细胞浆绿色荧光增强。罗丹明123染色，VK3 6 h组可见HeLa细胞浆内红色荧光强度明显降低(提示ΔΨm下降)。结论：氧化损伤能够诱导溶酶体及线粒体死亡途径，并且溶酶体的变化先于线粒体，提示溶酶体通透性在氧化应激诱导线粒体凋亡过程中具有重要作用。

氧化应激；溶酶体；线粒体；细胞凋亡

研究[1-3]发现：细胞内活性氧簇( reactive oxygen species,ROS)除了能引起线粒体膜通透性增加而参与细胞凋亡以外，还能直接损伤溶酶体膜。溶酶体膜通透性增加，就会导致溶酶体酶释放入细胞浆。另有研究[4]发现：溶酶体酶释放作用于线粒体，促进线粒体产生ROS，因此导致溶酶体膜通透性进一步增加。本文作者前期研究[5]发现：维生素K3 (Vitamin K3,VK3)能引起ROS增多，并诱导肿瘤细胞凋亡，而且线粒体融合分裂基因表达的改变与肿瘤细胞凋亡有关。然而，溶酶体及线粒体调节VK3引起肿瘤细胞凋亡过程的具体作用尚未明确。因此本实验以HeLa细胞作为研究对象，采用VK3复制氧化应激模型，观察VK3作用不同时间后，HeLa细胞溶酶体膜和线粒体膜变化的时间顺序以及凋亡相关蛋白caspase-3活化片段的蛋白表达情况，探讨溶酶体及线粒体在细胞凋亡过程中的时间顺序及其相互作用。

1 材料与方法

1.1 细胞、主要试剂和仪器 人HeLa 细胞购自中国科学院和北京协和医院。新生小牛血清购于Gibco公司，IMDM 培养基购自Hyclone公司；细胞裂解液RIPA购自碧云天生物技术研究所；MTT粉末、吖啶橙(AO)和罗丹明123均购自美国Sigma公司；caspase-3活化片段(cleaved caspase-3)和β-actin 抗体均购自Santa Cruz 公司；其他试剂均为国产分析纯。自动CO2恒温培养箱(Sanyo公司，日本)，蛋白质电泳装置及转移系统(Bio-rad公司，美国)，凝胶图像分析系统(上海天能科技有限公司GIS凝胶成像系统)，激光共聚焦显微镜(OLYMPUS FV1000，日本)。

1.2 细胞培养 HeLa细胞置于完全培养基(10% 新生牛血清，IMDM 培养液，pH7.4) 中，37℃、5 %CO2培养。实验分组：对照组(细胞用IMDM 培养)和VK3(终浓度为30 μmol·L-1)1 h、3 h、6 h、12 h组。

1.3 MTT 法检测细胞生存率 各组细胞以1×104/孔种至96孔板，每孔100 μL，每组细胞6复孔，于培养结束前4 h，加入5 g·L-1MTT 20 μL。培养结束后，倾去培养基，每孔加入DMSO 150 μL，振荡混匀，使结晶完全溶解，用酶联免疫检测仪在570 nm波长处测定其吸光度(A) 值。A值可间接反映活细胞数量，用以检测细胞活性。对照组细胞生存率为100%，其余各组细胞生存率=(各浓度组A值/对照组A值)×100%。

1.4 Western blotting法检测cleaved caspase-3蛋白表达 用RIPA裂解液提取细胞总蛋白，以β-actin水平作为等量蛋白质上样对照，取50 μg蛋白质样品进行SDS-PAGE电泳，转至硝酸纤维素膜上；5%奶粉室温封闭2 h后，用含0.01% Tween 20的TBS缓冲液(TBST)漂洗3次，每次10 min；加入相应的抗体cleaved caspase-3和β-actin (1∶200)，4℃孵育过夜，TBST漂洗3次后加入相应的辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶1 000)，37℃摇床温育2 h；TBST漂洗3次，每次10 min；DAB显色，凝胶图像分析系统分析蛋白的表达。

1.5 DCFH-DA染色检测细胞内ROS水平 将各组细胞的培养液弃掉，PBS洗2次，加入含DCFH-DA(10 μmol·L-1)的PBS 1 mL，37℃孵育20 min，PBS洗涤细胞3次(5 min·次-1)，以充分去除未进入细胞的DCFH-DA。激发波长488 nm，发射波长525 nm，激光共聚焦显微镜观察细胞内绿色荧光强度，判断细胞内的活性氧情况[6]。

1.6 AO染色[7]检测溶酶体稳定性 将AO加入各组细胞中，终浓度为1 μmol·L-1，37℃孵育15 min，弃去染料，用PBS 洗涤3次，405 nm激发光下激光共聚焦显微镜观察细胞内绿色荧光和红色荧光强度。

1.7 罗丹明123染色检测线粒体膜电势(ΔΨm) 将罗丹明加入各组细胞中，终浓度为10 μmol·L-1，避光，37℃孵育30 min (每隔10 min 振摇1次)[8]。PBS 洗涤3次，激发光波长为488 nm，发射光波长为534 nm，激光共聚焦显微镜下观察细胞内红色荧光强度，荧光强度愈强，ΔΨm愈大。

2 结 果

2.1 VK3作用不同时间点HeLa细胞的生存率 30 μmol·L-1VK3 1、3、6和12 h组细胞生存率分别为(98.6±2.32)%、(95.7±3.13)%、(88.6±4.67)%和(71.6±3.32)%，与对照组比较差异有统计学意义(Plt;0.05)。

2.2 Western blotting检测各组HeLa细胞cleaved caspase-3的表达水平 Western blotting法检测cleaved caspase-3蛋白表达，与对照组(0.02±0.01)比较，VK3 1 h和3 h组cleaved caspase-3表达水平(0.030±0.015和0.050±0.023)无明显变化(Plt;0.05)，VK3 6 h和12 h组cleaved caspase-3表达水平(0.500±0.025和0.600±0.015)明显增加(Plt;0.05)。见图1。

2.3 各组HeLa细胞的ROS水平 DCFH-DA染色检测结果显示：与对照组比较，VK3作用1、3、6和12 h，HeLa细胞内绿色荧光均增强，提示VK3作用后细胞内ROS水平增加(图2，见插页二)。

2.4 各组HeLa细胞的溶酶体膜通透性 AO染色共聚焦显微镜观察显示：与对照组比较，VK3作用1 h后胞浆内绿色荧光及红色荧光强度无变化，作用3、6和12 h后HeLa细胞的细胞浆绿色荧光增强，红色颗粒状荧光减弱，表明溶酶体膜稳定性出现下降(图3，见插页二)。

图1 Western blotting 检测VK3作用HeLa不同时间后caspase-3活化片段蛋白表达电泳图

Fig.1 Electrophorgram of expressions of cleaved caspase-3 proteins in HeLa cells after treated with VK3 for different time detected by Western blotting method

Lane 1: Control group;Lane 2: VK3 6 h group;Lane 3: VK3 12 h group.

2.5 各组HeLa细胞ΔΨm 罗丹明123染色共聚焦显微镜观察显示：与对照组比较，HeLa细胞在VK3作用1和3 h后细胞浆内红色荧光强度无变化，作用6及12 h后细胞浆内红色荧光强度明显降低，提示细胞ΔΨm下降(图4，见插页二)。

3 讨 论

溶酶体作为细胞内消化器官，参与细胞自溶、防御等生物过程。近年研究[9]发现：溶酶体在死亡信号作用下释放以组织蛋白酶为主的多种水解酶，参与细胞死亡，这一过程被称为溶酶体途径的凋亡。溶酶体膜通透性增加程度是决定细胞死亡类型的重要因素。

AO是一种能反映溶酶体功能状态的探针染料[10]。AO具有亲嗜溶酶体的特性，未带电荷时可以透过细胞膜，进入溶酶体内。一旦AO进入溶酶体，由于含有较高水平的质子而被质子化保留在溶酶体内，表现出红色颗粒状荧光，而细胞浆表现出绿色荧光。DCFH-DA染色结果显示：VK3从作用1 h开始，细胞内绿色荧光就增强，提示VK3作用后HeLa细胞内ROS水平增加。AO染色实验结果显示：VK3作用3 h后HeLa细胞浆绿色荧光增强，红色荧光减弱，提示VK3所诱导的ROS产生导致溶酶体膜通透性增加，VK3作用6 h更明显。由此可见，氧化应激诱导细胞死亡可能与溶酶体膜通透性增加有关。

大量的研究[10]表明：ΔΨm的破坏是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件之一，其发生在细胞核凋亡特征(染色质浓缩、DNA断裂)出现之前，一旦线粒体跨膜电位崩溃，则细胞凋亡不可逆转。本研究中VK3作用HeLa细胞6 h后，ΔΨm开始降低，提示线粒体膜通透性增加，线粒体损伤性变化的存在。本研究结果表明：VK3作用细胞后，ΔΨm降低是氧化应激诱导细胞死亡过程的一个机制，而且溶酶体死亡途径可能发生在线粒体死亡途径之前，从而启动溶酶体-线粒体死亡途径。从溶酶体膜通透性增加和线粒体膜电势降低的发生时间来看，溶酶体的变化先于线粒体。

线粒体膜通透性增加会促使线粒体外膜促凋亡蛋白细胞色素C释放入细胞浆，有利于caspase-3激活[11-13]。有研究[14]表明：肿瘤坏死因子-α诱导产生的ROS，引起溶酶体膜改变早于线粒体改变；溶酶体酶作用于线粒体，促其生成ROS，后者反作用于溶酶体导致更多溶酶体酶的释放。还有研究[15-16]显示：溶酶体组织蛋白酶B和D释放入细胞浆可以剪切Bcl-2家族蛋白Bid、Bax或Bak，引起线粒体外膜通透性增高，细胞色素C释放、激活caspase。本研究结果显示：VK3作用6和12 h细胞内caspase-3活化片段蛋白表达增加，提示线粒体凋亡途径被激活。本研究结果显示：VK3作用3 h时可见溶酶体膜通透性增加，VK3作用6 h可见线粒体膜通透性增加，而此时可见caspase-3被激活，进一步证明VK3引起溶酶体膜通透性增加，使线粒体膜通透性增加，从而激活caspase-3，发生线粒体凋亡，而线粒体的损伤又进一步加重了溶酶体的损伤；溶酶体酶膜通透性增加可引起溶酶体酶释放，同样也会导致溶酶体自身的损伤。两者不断地相互作用，使溶酶体-线粒体损伤不断加剧。溶酶体膜通透性增加可能是氧化应激诱导线粒体凋亡途径的至关重要的环节，但溶酶体膜通透及线粒体膜通透的传递信号还需进一步研究。

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TimeorderoflysosomalandmitochondrialcelldeathinoxidativeinjuryofcervicalcancerHeLacellsanditssignificance

YU Chun-yan1,LIU Xi2,YU Chun-rong3,ZHANG Yu4,SU Jing4,LIU Yu-he1

(1. Department of Pathology,College of Basic Medicine,Beihua University,Jilin 132013,China; 2. Experiment Center，College of Chemistry and Biology,Beihua University,Jilin 132013,China; 3.Department of Toxicology,JOINN Laboratories,Beijing 100176,China;4. Department of Pathophysiology, Norman Bethune College of Medicine,Jilin University,Changchun 130021,China)

ObjectiveTo investigate the time order of lysosomal and mitochondrial cell death in human HeLa cells after oxidative stress injury and its significance,and to clarify the role of lysosomal membrane permeabilization in the process of mitochondrial apoptosis induced by oxidative stress.MethodsThe HeLa cells line was used for the study.Oxidative stress model of cervical cancer HeLa cells was established by vitamin K3 (VK3).The cells were divided into control,V3 1 h,VK3 3 h,VK3 6 h and VK 12 h groups.The vitalities of HeLa cells in various groups were measured by MTT assay.The levels of reactive oxygen species(ROS) were determined by DCFH-DA.The lysosomal membrane permeabilization was observed by AO staining,and the mitochondrail membrane permeabilization in HeLa cells was detected by Rhodamine 123 staining.The expression of apoptosis-related protein cleaved caspase-3 was determined by Western blotting method.ResultsCompared with control group,the survival rates of HeLa cells in VK3 6 h and VK3 12 h groups were decreased (Plt;0.05).Compared with control group,the cleaved caspase-3 expression levels in VK 36 h and VK3 12 h groups were increased detected by Western blotting method(Plt;0.05).The DCFH-DA results showed that after VK3 treatment for 1 h,3 h, and 6 h,the levels of green fluoresence were increased in HeLa cells.The AO staining results showed that VK3 treatment for 3 and 6 h caused a decline in the red staining of lysosomes and increase in green staining of cytoplasm.The Rhodamine 123 results revealed that VK3 treatment for 6 h induced a drop in Rhodamine 123 red staining of cytoplasm.ConclusionOxidative stress damage can induce lysosomal and mitochondrial cell death in HeLa cells,and lysosomal cell death eventuates ahead of mitochondrial,which prompting the lysosomal membrane permeabilization plays an important role in mitochondrial apoptosis pathway induced by oxidative stresss..

oxidative stress;lysosome;mitochondria;apoptosis

1671-587Ⅹ(2013)05-0872-04

10.7694/jldxyxb20130503

2013-03-14

国家自然科学基金资助课题(81202552，81272876)；吉林省教育厅科研基金资助课题(吉教科合字2011第117号，吉教科合字2012第394号)；吉林省科技厅自然科学基金资助课题(201215103)

于春艳(1975-)，女，吉林省吉林市人，副教授，医学博士，主要从事肿瘤病理学方面的研究。

刘玉和(Tel:0432-64608556，E-mail: bhlyh1959@163.com)

R363.2

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