五味子提取物对脑胶质瘤神经球细胞增殖的抑制作用

齐 玲，金 宏，沈 楠，李蕴潜， 赵东海，田 晶

(1.吉林医药学院基础医学院病理学教研室，吉林 吉林 132013；2.吉林医药学院实验中心，吉林 吉林 132013； 3.吉林大学第一医院神经外科，吉林 长春 130021)

五味子提取物对脑胶质瘤神经球细胞增殖的抑制作用

齐 玲1，金 宏2，沈 楠2，李蕴潜3， 赵东海1，田 晶1

(1.吉林医药学院基础医学院病理学教研室，吉林 吉林 132013；2.吉林医药学院实验中心，吉林 吉林 132013； 3.吉林大学第一医院神经外科，吉林 长春 130021)

目的：探讨五味子提取物对脑胶质瘤神经球细胞生长的作用，并初步探讨其可能的机制。方法：培养脑胶质瘤SHG-44细胞，将其置入干细胞培养液[神经培养基加入B27添加物、表皮生长因子(EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)]中进行培养，3代以后用于实验。将脑胶质瘤SHG-44细胞分为对照组，50、100和200 mg·L-1五味子提取物组，MTT法检测各组神经球细胞的增殖抑制率，酶联免疫吸附实验检测五味子提取物作用后神经球培养上清中Bcl-2、Bax和caspase-3 蛋白表达水平。结果：MTT法检测，与对照组比较，50、100和200 mg·L-1五味子提取物组SHG-44神经球细胞24、48和72 h时增殖抑制率均升高(Plt;0.01)；酶联免疫吸附实验，不同浓度五味子提取物作用神经球48 h后，培养上清中Bcl-2和Bax蛋白表达水平均下降，以Bcl-2蛋白表达水平下降更为明显，与对照组比较，100和200 mg·L-1五味子提取物组Bcl-2蛋白表达水平明显下降(Plt;0.05或Plt;0.01)；与对照组比较，不同浓度五味子提取物组Bax/Bcl-2值均升高(Plt;0.05或Plt;0.01)，50 mg·L-1五味子提取物组培养上清中caspase-3蛋白水平较对照组明显升高(Plt;0.01)。结论：五味子提取物可能是通过上调Bax/Bcl-2值后促凋亡因素占优势，使神经球细胞凋亡而抑制胶质瘤神经球细胞的生长。

五味子；胶质瘤；神经球；Bax蛋白；Bcl-2蛋白；caspase-3蛋白

中药五味子具有抗肿瘤作用，木脂素是其抗肿瘤的主要成分之一[1]。最近研究[2-4]表明：脑肿瘤中存在的肿瘤干细胞是肿瘤发生、复发及耐药的源头，而应用直接培养法获得的神经球细胞具有肿瘤干细胞特性[4]。研究[5-7]发现：五味子总木脂素等可以明显抑制胶质瘤细胞的生长，但五味子提取物对胶质瘤神经球细胞的作用还未见报道。因此，本研究通过探讨五味子提取物对脑胶质瘤神经球细胞生长的作用，初步阐明其可能的机制，为该药早日应用于临床提供依据。

1 材料与方法

1.1 细胞和主要试剂 人脑胶质瘤SHG-44细胞由吉林大学第一医院神经外科于洪泉主治医师惠赠。五味子提取物由北华大学长白山资源保护与开发研究所提供，主要成分为五味子木脂素；RPMI-1640(美国Hyclone公司)；神经培养基、0.25%胰蛋白酶、小牛血清和B27添加物(美国Gibco公司)；MTT(美国Sigma公司)；二甲基亚砜(DMSO，美国Thermo公司)；人碱性成纤维生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)和人表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)均为英国Pepro Tech公司产品，Bcl-2、Bax和caspase-3 兔抗人多克隆抗体为北京中杉公司产品。

1.2 脑胶质瘤SHG-44细胞及神经球细胞的培养 将人脑胶质瘤SHG-44细胞接种于含10%小牛血清的RPMI-1640培养基中，37℃、5%CO2及饱和湿度条件下培养，隔日换液。将SHG-44细胞以1×104cm-2的密度接种到75 cm2培养瓶中，加入干细胞培养液(stem cells media，SCM)，置于5% CO2、37℃培养箱中在饱和湿度下进行培养。每天倒置显微镜下观察细胞生长状况，3～5 d 换液1次，培养液重悬细胞，机械吹打成单细胞悬液，按1∶2比例传代，3代以后的神经球细胞用于后续实验中。

1.3 MTT法检测SHG-44神经球细胞的增殖 取SHG-44神经球细胞，0.25%胰酶消化机械吹打后，苔盼兰计数活细胞，用SCM重悬细胞，调整细胞密度为1×106mL-1，以每孔100 μL均匀接种于96孔板中，置入37℃、5% CO2培养箱中进行培养。24 h后加入五味子提取物(终浓度分别为0、50、100和200 mg·L-1)，每个浓度设5个复孔，分别作用24、48和72 h，每孔再加入MTT 20 μL，继续孵育4 h，弃上清，每孔加入DMSO 150 μL，震荡15 min，酶联免疫检测仪490 nm波长处测定各孔吸光度(A)值，以不加细胞的空白孔调零。增殖抑制率(%)=(1-实验组A值/对照组A值)×100%。

1.4 ELISA法测定神经球细胞培养上清中Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白表达水平 将SHG-44神经球细胞用0.25%胰酶消化并机械吹打成单细胞后，接种于24孔培养板中，加入不同浓度五味子提取物(使其终浓度分别为0、50、100和200 mg·L-1)作用48 h，每组5个复孔，加药期间使用SCM培养基。取培养上清包被96孔酶标板4℃过液，37℃封闭1 h，加入Bcl-2、Bax和caspase-3抗体(1∶500稀释)4℃过夜，次日加入二抗(1∶1 000稀释)室温下孵育2 h，DAB显色，当有颜色变化时，加入终止液。酶联免疫检测仪492 nm处测定A值，以空白对照组(无细胞)调零。表达水平以A值表示。

2 结 果

2.1 神经球细胞在SCM中的生长情况 脑胶质瘤SHG-44细胞培养1～2 d仍可见大部分细胞贴壁生长，只有少量细胞变大、变圆；3 d以后部分细胞开始死亡，随着时间增加死亡细胞逐渐增多；1周后可见到部分细胞呈球状生长，逐渐形成神经球样细胞，在传代过程中难以吹散；3代以后大部分细胞形成明显的神经球，可用于后续实验。细胞在普通培养液生长及SCM中形成神经球情况见图1。

2.2 五味子提取物作用于神经球细胞后细胞增殖抑制率 50、100和200 mg·L-1五味子提取物分别作用于SHG-44神经球细胞24、48和72 h，神经球细胞的增殖受到明显抑制。与对照组比较，各剂量五味子提取物组细胞增殖的抑制率均明显升高，差异有统计学意义(Plt;0.01)。见表1。

2.3 神经球细胞培养上清中Bcl-2、Bax和caspase-3表达水平 不同浓度五味子提取物作用SHG-44神经球细胞48 h后，神经球细胞Bcl-2和Bax蛋白表达水平均下降，尤其是Bcl-2蛋白表达水平下降更为明显。与对照组比较，100和200 mg·L-1五味子提取物组Bcl-2蛋白表达水平明显下降(Plt;0.05或Plt;0.01)；与对照组比较，各浓度五味子提取物组Bax/Bcl-2比值均升高(Plt;0.05或Plt;0.01)。50 mg·L-1五味子提取物组培养上清中caspase-3蛋白水平较对照组明显升高(Plt;0.01);100和200 mg·L-1五味子提取物组caspase-3蛋白水平均降低，但与对照组比较差异均无统计学意义(Pgt;0.05)。见表2。

图1 胶质瘤SHG-44细胞在普通培养液生长(A)和神经球在干细胞培养液中生长情况(B)(×400)

Fig.1 Growth of SHG-44 in normal culture media(A) and neuroshperes in stem cells media(B)(×400)

表1 各组SHG-44神经球细胞的增殖抑制率

GroupInhibitoryratesofproliferation(t/h) 244872Control000Schisandrachinensisextract 50mg·L-119．22±4．13∗15．66±2．16∗28．99±2．77∗ 100mg·L-118．47±2．62∗29．43±3．55∗35．57±2．11∗ 200mg·L-122．08±1．68∗29．68±3．27∗32．67±3．36∗

*Plt;0.01 compared with control group.

表2 各组SHG-44神经球细胞培养上清中Bcl-2、Bax 和caspase-3表达水平

Tab.2 Expression levels of Bcl-2,Bax and caspase-3 protein in SHG-44 neuroshperes in various groups(n=5,±s)

*Plt;0.05，**Plt;0.01 compared with control group.

3 讨 论

在人体各部位的肿瘤中，脑肿瘤对生命的威胁最大，对生活质量的影响也最明显。最近肿瘤生物学方面研究[8]发现：肿瘤的生长和更新是由一小群肿瘤干细胞所驱动，肿瘤干细胞既是脑肿瘤发生、复发的根源，也是肿瘤细胞对放、化疗等产生抵抗的根源。五味子是长白山的特色药物，是吉林省中药的优势产业。研究[1]表明：五味子木脂素和多糖具有明确的抗肿瘤作用。

目前，对木脂素抗肿瘤作用研究较少，五味子乙素(Schisandrin B，Sch B)属木脂素类，是五味子木脂素的主要成分之一[9]，研究[10-11]表明：Sch B可导致H22肝癌移植瘤细胞中caspase-3、caspase-8和caspase-9表达增高。Sch B 还可能通过调节Cyclin D1 mRNA，阻滞肿瘤细胞的分裂周期，减慢其分裂，加速其凋亡[12]；同时可以增强促凋亡蛋白Bax 的表达[13]，降低凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达[14]。但对于胶质瘤中神经球的作用及其机制的研究尚未见报道。本实验利用直接培养法，从人脑胶质瘤细胞株SHG-44获得神经球细胞，经50、100和200 mg·L-1五味子提取物作用24、48和72 h后，均可以明显抑制神经球细胞的生长。本研究结果表明：五味子提取物可具有明显抑制胶质瘤神经球细胞体外生长的作用。

本研究检测神经球细胞培养上清中Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白表达情况结果显示：各浓度五味子提取物组中Bcl-2和Bax蛋白分泌均减少，尤其是Bcl-2蛋白分泌减少更加明显，各浓度五味子提取物组Bax/Bcl-2比值均较对照组升高，50 mg·L-1五味子提取物组caspase-3表达水平明显升高，而100和200 mg·L-1五味子提取物组caspase-3表达水平呈下降趋势，但差异无统计学意义。在线粒体传导过程中，凋亡抑制因子Bcl-2与凋亡关系密切，Bax/Bcl-2值直接对细胞凋亡产生影响[15]。

综上所述，五味子提取物可以抑制胶质瘤神经球细胞的生长，其机制可能是通过凋亡的线粒体途径，抑制Bcl-2表达，使促凋亡因素占优势，从而引起凋亡发生，抑制神经球的生长。但五味子提取物中含有多种成分，其各成分的作用还有待于今后深入研究。

[1] 任丽佳,李 林,殷放宙,等.五味子抗肿瘤活性成分及作用机制研究进展[J].中国药理学通报,2012,29(1): 140-142.

[2] Wang R,Chadalavada K,Wilshire J,et al.Glioblastoma stem-like cells give rise to tumour endothelium[J].Nature,2010,468(7325): 829-833.

[3] Silvestre DC,Pineda Marti JR,Hoffschir F,et al.Alternative lengthening of telomeres in human glioma stem cells[J].Stem cells,2011,29(3): 440-451.

[4] Qi L,Bellail AC,Rossi MR,et al.Heterogeneity of primary glioblastoma cells in the expression of caspase-8 and the response to TRAIL-induced apoptosis[J].Apoptosis,2011,16(11): 1150-1164.

[5] 金 宏,温 娜,纪鹏艳,等.不同浓度五味子乙素对脑胶质瘤SHG-44细胞增殖的影响[J].中国实验诊断学,2011,15(12): 2026-2027.

[6] 金 宏,温 娜,刘 威,等.五味子总木脂素对大鼠C6 脑胶质瘤细胞增殖的影响[J].中风与神经疾病杂志,2012,29(7): 613-614.

[7] 吴海星,徐希妮,刘玉清,等.五味子乙素对脑胶质瘤的体内抑制作用研究[J].吉林医药学院学报,2013,34(1): 4-6.

[8] Dirks PB.Brain tumor stem cells: the cancer stem cell hypothesis writ large[J].Mol Oncol,2010,4(5): 420-430.

[9] 顾 颖,李 凌.五昧子乙素促进多柔比星诱导肝癌细胞SMMC7721凋亡的研究[J].实用肿瘤杂志，2006,23(5): 412-461.

[10]吕冬霞,崔 健,刘月霞,等.五味子乙素联合顺铂诱导H22肝癌移植瘤细胞凋亡过程中caspase-3,8,9表达的研究[J].中国老年学杂志，2009,29(2): 416-418.

[11]李 玲.五味子乙素增敏蒽环类的抗肿瘤作用和减轻其心肌毒性的体内外实验研究[D].杭州：浙江大学，2006.

[12]Liu XN,Zhang GY,Jin XD,et al.Inhibitory effort of schisandrin B on gastric cancer cellsinvitro[J].World J Gastroenterol,2007,13(48): 6506-6511.

[13]Yim SY,Lee YJ,Lee YK,et al.Gomisin N isolated fromSchisandra chinensis significantly induces anti-proliferative andpro-apoptotic effects in hepatic carcinoma [J].Mol Med Report,2009,2(5):725-732.

[14]Park C,Choi YW,Hyun SK,et al.Induction of G1 arrest and apoptosis by schisandrin C isolated from Schizandra chinensis Baillin human leukemia U937 cells[J].Int J Mol Med,2009,24(4): 495-502.

[15]商 蕾,王 玲,孙宏丽,等.氧化苦参碱对大鼠急性心肌缺血时心肌细胞凋亡的影响[J].中国药学杂志,2007,42(7): 501-504.

InhibitoryeffectofSchisandrachinensisextractonproliferationofneurospheresofglioma

QI Ling1，JIN Hong2,SHEN Nan2，LI Yun-qian3,ZHAO Dong-hai1,TIAN Jing1

(1.Department of Pathology,Jilin Medical College,Jilin 132013,China；2.Experimental Center,Jilin Medical College,Jilin 132013,China;3.Department of Neurosurgery, First Hospital,Jilin University,Changchun 130021,China)

ObjectiveTo explore the effect of Schisandra chinensis extract on neurospheres of glioma and to study the possible mechanism of inhibition.MethodsGlioma SHG-44 cells were cultured in stem cells media (containing neurobasal media supplemented with B27,EGF and bFGF) and the neuroshperes were used in this experiment after 3 passages.Neurospheres were cultured and divided into control,50,100 and 200 mg·L-1Schisandra chinensis extract groups.The influence of Schisandra chinensis extract in proliferation of neuroshperes was measured by MTT assay.The levels of Bcl-2,Bax and caspase-3 proteins were measured by ELISA.ResultsCompared with control group,the inhibitory rates of proliferation of neurospheres in 50,100 and 200 mg·L-1Schisandra chinensis extract groups were significantly decreased after treated for 24,48 and 72 h (Plt;0.01). The ELISA results showed that compared with control group,the secretion of Bcl-2 and Bax protein was decreased,especially the levels of Bcl-2 protein in 100 and 200 mg·L-1Schisandra chinensis extract groups (Plt;0.05 orPlt;0.01);compared with control group,the ratios of Bax/Bcl-2 in 50,100 and 200 mg·L-1Schisandra chinensis extract groups were increased (Plt;0.01).Compared with respective control group,the expression of caspase-3 protein in 50 mg·L-1group was significantly increased (Plt;0.01).ConclusionSchisandra chinensis extracts might up-regulate the ratio of Bax/Bcl-2 and promote the secretion of apoptosis factors to induce the apoptosis and inhibit the growth of glioma neuroshperes.

Schisandra chinensis;glioma;neuroshpere;bax protein;bcl-2 protein;caspase-3 protein

1671-587Ⅹ(2013)05-0876-04

10.7694/jldxyxb20130504

2013-04-17

国家自然科学基金资助课题(81201671)；吉林省教育厅科研基金资助课题(2011281，2012330)

齐 玲(1974-)，女，吉林省吉林市人，副教授，医学博士，主要从事肿瘤药物研究。

齐 玲(Tel：0432-64560027，E-mail：qiling1718@163.com)

R739.4

A