高压氧对大脑中动脉阻塞模型大鼠脑组织中Mcl-1表达的影响及其脑组织损伤作用机制

陆玉熊，康劲松，王伟伟，杨晓春，王修深，孙连坤

(吉林大学白求恩医学院病理生理学系，吉林 长春 130021)

高压氧对大脑中动脉阻塞模型大鼠脑组织中Mcl-1表达的影响及其脑组织损伤作用机制

陆玉熊，康劲松，王伟伟，杨晓春，王修深，孙连坤

(吉林大学白求恩医学院病理生理学系，吉林 长春 130021)

目的: 探讨高压氧(HBO)对大脑中动脉阻塞(MCAO)模型大鼠脑组织抗凋亡蛋白髓细胞白血病因子1(Mcl-1)表达的影响，阐述高压氧对受损脑组织的损伤作用机制。 方法: 随机选取20只健康雄性Wistar大鼠，分为假手术(Sham)组6只、模型(MCAO)组和HBO组各7只。采用线栓法制作MCAO模型。Sham组仅进行血管分离，MCAO组缺血90 min进行再灌注，HBO组在MCAO组的基础上，于再灌注3 h时，给予3.0绝对大气压(ATA)高压纯氧治疗1 h；所有大鼠于再灌注24 h后处死。取脑组织冠状切片，用1%红四氮唑(TTC)染色检测并计算梗死面积；取大脑皮层梗死边缘区组织提取RNA和蛋白质，采用RT-PCR法检测Mcl-1 mRNA表达水平，Western blotting法检测Mcl-1蛋白表达水平。 结果: 与MCAO组比较，HBO组大鼠脑梗死面积比明显增加(Plt;0.01)。与Sham组比较，MCAO组大鼠脑组织中Mcl-1 mRNA表达水平显著升高(Plt;0.01)；与MCAO组比较，HBO组大鼠脑组织中Mcl-1 mRNA表达水平显著升高(Plt;0.01)。与Sham组比较，HBO组和MCAO组大鼠脑组织中的Mcl-1蛋白表达水平显著降低(Plt;0.01)；HBO组与MCAO组Mcl-1蛋白表达水平比较差异无统计学意义(Pgt;0.05)。与MCAO组比较，HBO组Bax/Mcl-1水平明显升高(Plt;0.01)。 结论: 高压氧可能通过促进Mcl-1的降解，引起Bax/Mcl-1平衡失调，导致神经细胞凋亡而加剧组织损伤。

高压氧；大脑中动脉阻塞；梗死边缘区；髓细胞白血病因子1；细胞凋亡

脑缺血发病6 h内，使用压强为2.5或3.0绝对大气压(atmospheres absolute,ATA)的高压氧(hyperbaric oxygen,HBO)作为供氧方案可能具有一定的治疗意义[1-6]，但是其动物实验尚未取得完全一致的结果[7-9]，目前还存在争议，主要是在高压氧治疗过程中缺血神经元的死亡或存活机制尚未阐明。Bcl-2家族蛋白是精细调控细胞死亡的关键蛋白，根据其功能不同分为抗凋亡和促凋亡两大类，抗凋亡蛋白Mcl-1为新发现的一种Bcl-2家族蛋白成员，与其他Bcl-2抗凋亡蛋白相比，Mcl-1 拥有巨大N端结构域，这一区域受到多种因素的调节而影响其稳定性，从而对细胞命运产生不同的效应[10-11]。目前对Mcl-1在脑缺血神经元中的调控作用未见相关报道。本实验使用线栓法制备大鼠大脑中动脉阻塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型，造成大鼠脑缺血再灌注损伤，采用高压氧对其进行供氧处理，并对高压氧条件下的Mcl-1表达情况及其可能的作用机制进行分析，为高压氧的临床运用提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器 Bax抗体、Mcl-1抗体和β-actin抗体(Santa公司,美国)；Trizol试剂(Invitrogen公司，美国)；Mcl-1和GAPDH引物由上海生工公司合成；其他试剂均由北京化工厂提供。MCAO栓线(沙东生物，中国北京)；大鼠大脑切片专用槽(Alto公司,美国)；蛋白质电泳装置及转移系统(Bio-rad公司,美国)； ECL显色系统(Gene公司,英国)；PCR仪(Takara公司,日本)；BI-2000图像分析系统(泰盟科技，中国成都)；全自动数码凝胶成像系统(天能公司，中国上海)；笔式电凝器(Evergreen公司,中国武汉)；手术器械均由上海手术器械公司提供。

1.2 实验动物及分组 雄性Wistar大鼠20只，体质量250～300 g，由吉林大学白求恩医学院实验动物中心提供，合格证编号：SCXK-(吉)2008-0005。将大鼠随机分为假手术(Sham)组6只，模型(MCAO)组和HBO组各7只。Sham组大鼠除不将栓线插入颈内动脉外其余同MCAO组。MCAO组大鼠采用线栓法造成左侧脑缺血90 min再灌注。HBO组大鼠在MCAO组的基础上，于再灌注3 h时给予3.0 ATA高压纯氧治疗1 h。所有大鼠于再灌注24 h后处死。

1.3 大鼠局灶性脑缺血模型制作 大鼠经腹腔注射10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)麻醉。自颈中部剪开皮肤，钝性分离颈总、颈外、颈内动脉血管，电凝颈外侧支，并在颈外动脉远心端约5 mm处用1/3的医用非吸收1#缝合线结扎，在颈内外分叉处的颈外支上以1#线轻打活结备用，夹闭颈总动脉和颈内动脉，然后使用显微眼科剪剪断颈外动脉，并插入MCAO栓线，栓线通过活结后，稍微系紧活结，打开颈内动脉夹，平稳插入栓线，进线约1.8 cm时感到阻力，停止插线，系紧活结并打开颈总动脉夹；待大鼠苏醒后使用Longa评分[12]，3分者进入下一步实验；1.5 h后再次麻醉大鼠并拔出栓线。注意手术过程中保持大鼠肛温为37℃。

1.4 高压氧处理 再灌注后3 h给予3.0 ATA纯氧高压，其中升压10 min，维持压力1 h，降压20 min；室温自由进食进水24 h后处死大鼠并取组织进行下一步实验。

1.5 红四氮唑(TTC)染色检测大脑梗死面积 将取出的脑组织放于大鼠大脑专用槽内作冠状切片，每片厚度为2 mm，共5块，浸没于配制好的1% TTC溶液中，37℃避光，5 h后翻动组织块，10 h后将组织取出放于平板上拍照保存。图像经BI-2000图像分析系统分析。各组大鼠大脑梗死面积以各切片受损总面积与切片总面积的百分比表示。

1.6 Western blotting法检测Mcl-1和Bax蛋白表达 提取大鼠大脑皮质梗死边缘区组织蛋白，配制12%丙烯酰胺凝胶并电泳分离，将分离的蛋白转移至甲醇活化的PVDF膜上，用5%脱脂奶粉封闭膜4 h以上，封一抗4℃过夜，磷酸盐吐温缓冲液(PBST)洗3次，每次10 min，封二抗室温2 h以上，再次磷酸盐吐温缓冲液洗3次，每次10 min，使用ECL发光液发光显色并计算灰度值，并以β-actin作为内参以确保各组间总蛋白等量。

1.7 RT-PCR法检测Mcl-1 mRNA表达 按商品说明书提取大鼠大脑皮质梗死边缘区组织RNA，据RNA浓度所需模板量，加入到逆转录体系中42℃水浴1 h。取逆转录产物加入PCR体系中，27个循环后进行琼脂糖凝胶电泳，使用天能凝胶成像系统对cDNA条带进行亮度分析，并以GAPDH作为内参照以确保各组间总RNA等量。Mcl-1引物，上游引物: 5′-CTCTCATTTCTTTTGGTGCCT-3′,下游引物: 5′-ATTCCTGATGCCACCTTCTA-3′；GAPDH引物，上游引物： 5′-GGGTGATGCTGGTGCTGAGTATGT-3′,下游引物: 5′-AAGAATGGGAGTTGCTGTTGAAGT-3′。

2 结 果

2.1 各组大鼠脑梗死面积 MCAO组大鼠平均脑梗死面积百分比(13.52%±0.81%)显著高于HBO组(22.76%±0.52%)，差异有统计学意义(Plt;0.01)。

2.2 各组大鼠脑组织中Mcl-1 mRNA和蛋白表达水平 与Sham组比较，MCAO组大鼠脑组织中Mcl-1 mRNA表达水平显著升高(Plt;0.01)；与MCAO组比较，HBO组大鼠脑组织中Mcl-1的mRNA表达水平显著升高(Plt;0.01)。与Sham组比较，HBO和MCAO组大鼠脑组织中的Mcl-1蛋白表达水平显著降低(Plt;0.01)；但HBO组与MCAO组大鼠脑组织中的Mcl-1蛋白表达水平差异无统计学意义(Pgt;0.05)。与MCAO组比较，HBO组Bax/Mcl-1水平明显升高(Plt;0.01)。见图1和表1。

3 讨 论

在正常情况下，Mcl-1与Bax结合抑制细胞凋亡[10，13]。本实验中MCAO大鼠经高压氧处理后，大鼠脑梗死面积较MCAO组明显增加，表明了高压氧的损伤作用；HBO组大鼠脑组织Mcl-1 mRNA表达水平较MCAO组显著升高，且MCAO组较sham组显著升高，表明MCAO损伤可使脑组织Mcl-1 mRNA表达上调，而高压氧处理可使Mcl-1表达进一步上调，提示HBO组大鼠脑组伤加重，机体通过上调Mcl-1抑制细胞凋亡。HBO组与MCAO组Mcl-1蛋白表达比较差异无统计学意义，但两组均显著低于Sham组。上述Mcl-1的转录情况和Mcl-1蛋白水平变化结果表明：Mcl-1在MCAO损伤和高压氧处理过程中均发生降解，且HBO组Mcl-1蛋白降解能力强于MCAO组。

图1 各组大鼠脑组织中Mcl-1 mRNA(A)和蛋白(B)表达电泳图

Fig.1 Electrophoregram expressions of Mcl-1 mRNA(A) and protein(B) in rat brain tissue in various groups

L: injury side;R: control side.

表1 各组大鼠脑组织中Mcl-1 mRNA和蛋白表达水平

Tab.1 Expressions of Mcl-1 mRNA and protein in brain tissue of rats in various groups[n=3,η/(±s)%]

L:Injury side;R: Control side.

*Plt;0.01 compared with sham (L) group;△Plt;0.01 compared with MCAO (L) group.

本研究中对促凋亡蛋白Bax的检测表明：HBO组 Bax/Mcl-1明显高于MCAO组。由于已有实验[14]证实：Bax/Mcl-1的平衡失调可导致人类中性粒细胞的凋亡。因此本文作者推断：发生脑缺血后Mcl-1被降解，机体通过上调Mcl-1对抗损伤，而高压氧可使Mcl-1降解进一步增加，导致Bax/Mcl-1平衡失调而促进神经元凋亡。已有研究[15-17]表明：Mcl-1通过泛素-蛋白酶体途径进行降解并导致神经细胞凋亡，然而高压氧导致Mcl-1降解的确切机制还需要进行深入研究。

综上所述，高压氧可通过促进Mcl-1降解增加来促进神经元的凋亡，加剧缺血组织损伤。

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InfluenceofhyperbaricoxygeninMCl-1expressioninbraintissueofratMCAOmodelsandmechanismofitsbraintissueinjuryeffect

LU Yu-xiong,KANG Jin-song,WANG Wei-wei,YANG Xiao-chun,WANG Xiu-sheng， SUN Lian-kun

(Department of Pathophysiology,Norman Bethune College of Medicine,Jilin University， Changchun 130021,China)

ObjectiveTo explore the effect of hyperbaric oxygen(HBO) on brain tissue of rats suffered transient middle cerebral artery occlusion (MCAO) and the Mcl-1 expression in brain cortex,and to demonstrate its mechanism.Methods20 healthy male Wistar rats were chosen and separated randomly to sham group(n=6),MCAO group(n=7) and HBO group(n=7).The MCAO models were established by nylon strand method.In sham group,the blood vessels were dissected and the strand was not inserted to middle artery；the rats in MCAO group were reperfused after 90 min ischemia,and the rats in HBO group were given pure oxygen at 3.0 atmospheres absolute (ATA) for 60 min after 3 h reperfusion.24 h after reperfusion,all the rats were killed.The infarct area of coronal brain section was calculated with 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) staining;the expressions of Mcl-1 mRNA and protein in cortex of penumbra were detected by RT-PCR and Western blotting,respectively.ResultsCompared with MCAO group,the infarct area ratio of the rats in HBO group was increased obviously (Plt;0.01).Compared with sham group, the Mcl-1 mRNA level in brain tissue of the rats in MCAO group was up-regulated notably(Plt;0.01).Compared with MCAO group,the Mcl-1 mRNA level in brain tissue of the rats in HBO group was raised significantly(Plt;0.01). Compared with sham group,the Mcl-1 protein contents in brain tissue of the rats in MCAO and HBO groups were decreased significantly (Plt;0.01);but there were no statistically significant differences(Pgt;0.05).Compared with MCAO group,the Bax/Mcl-1 levels in HBO group were increased significantly (Plt;0.01).ConclusionHBO may promote the damage of MCAO rats through increasing the degradation of Mcl-1.

hyperbaric oxygen;middle cerebral artery occlusion;marginal zone myeloid cell leukemin-1; apoptosis

1671-587Ⅹ(2013)05-0880-04

10.7694/jldxyxb20130505

2013-03-14

国家自然科学基金资助课题(81272876)；吉林省科技厅科研基金资助课题(201015200)

陆玉熊(1988-)，男，云南省巧家县人，在读医学硕士，主要从事自噬与细胞死亡方面研究。

孙连坤(Tel:0431-85619402，E-mail:sunlk@jlu.edu.cn)

R840.511

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