颈椎稳定性异常老龄小鼠脑海马神经细胞中Bcl-2和Bax的表达

朱彤彤,林桂淼,范文静,刘光耀,赵丽华,赵丽晶,赵丽娟

(1. 吉林大学白求恩医学院病理生理学系,吉林 长春130021；2. 吉林大学中日联谊医院骨科,吉林 长春130033； 3. 深圳大学医学院泌尿与生殖中心,广东 深圳 518061； 4.上海中医药大学护理学院基础护理系,上海201203)

赵丽娟(Tel：0431-85619485，E-mail：titian2003@sina.com)

颈椎稳定性异常老龄小鼠脑海马神经细胞中Bcl-2和Bax的表达

朱彤彤1,2*,林桂淼1,3,范文静1,4,刘光耀2,赵丽华1,赵丽晶1,赵丽娟1

(1. 吉林大学白求恩医学院病理生理学系,吉林 长春130021；2. 吉林大学中日联谊医院骨科,吉林 长春130033； 3. 深圳大学医学院泌尿与生殖中心,广东 深圳 518061； 4.上海中医药大学护理学院基础护理系,上海201203)

目的：探讨颈椎失稳老龄小鼠脑海马神经细胞凋亡相关基因Bcl-2和Bax的表达，阐明颈椎失稳所致老龄小鼠记忆和学习能力下降的机制。方法：选取ICR小鼠20只,随机分为模型组和对照组,每组10只，分组后模型组采用颈椎乳酸堆积法制备小鼠颈椎稳定性异常病理模型，对照组未经任何处理。水迷宫实验检测小鼠学习和记忆能力；HE染色观察脑海马神经细胞形态学变化；TUNEL染色观察脑海马神经细胞凋亡情况；RT-PCR和免疫组织化学法检测小鼠脑海马组织Bcl-2、Bax mRNA和蛋白的表达情况。结果：与对照组比较,模型组小鼠水迷宫实验游全程时间和错误次数显著增加(Plt;0.01)；HE染色，与对照组比较，模型组小鼠脑海马神经细胞排列稀疏，死亡细胞明显增多；TUNEL染色，与对照组(7.52%±0.99%)比较，模型组脑海马凋亡细胞数(29.63%±1.63%)明显增多(Plt;0.01)；RT-PCR和免疫组织化学染色，模型组小鼠脑海马神经细胞Bcl-2表达明显减弱，Bax表达明显增强。结论：颈椎稳定性异常导致的小鼠脑海马神经细胞Bcl-2表达下调，Bax表达上调，可能是促进其细胞凋亡的主要机制之一。

颈椎稳定性异常；海马； Bcl-2；Bax；细胞凋亡

长时间保持头颈前屈姿势这种非生理性体位会使颈椎稳定性和灵活性遭到破坏，最终导致颈椎关节内的结构、神经和血管受累。段俊峰等[1]研究认为：椎间联结破坏后可致椎间关节错位，椎间孔变形变窄，压迫神经根并使椎动脉血流减少，交感神经调节异常而引起疾病。目前国内外关于血管性痴呆动物模型的制备多采用大脑中动脉或颈总动脉血管结扎的方法[7-8]。本研究组所制备模型是通过在小鼠寰枢椎间长期注射30%乳酸,破坏其稳定性,渐进性地椎动脉供血不足而致大脑慢性缺血,最终导致小鼠学习记忆能力下降,关于这种更接近于人类临床上血管性痴呆发病过程的动物模型除本研究组既往实验所得报道外尚未见其他报道。本研究组既往的研究[2-6]显示：老龄小鼠的颈椎失稳可明显促进小鼠的衰老进程、降低其学习记忆能力、促进脑组织β淀粉样蛋白沉积以及脑海马神经细胞凋亡等。本研究旨在观测颈椎失稳老龄小鼠脑海马神经细胞Bcl-2和Bax蛋白的表达变化，探讨脑海马神经细胞凋亡的可能机制。

1 材料与方法

1.1 动物、主要试剂和仪器 10月龄雌性清洁级ICR小白鼠20只，购于吉林大学白求恩医学院实验动物中心，动物合格证号：SCXK(吉)2007-0003。TUNEL试剂盒(武汉博士德公司)，逆转录聚合酶链反应(RT-PCR) RNA提取试剂盒(Trizol Kit)、逆转录酶(MMLV-RT)、脱氧核糖核酸酶(DNase R 0.1)、TaqDNA聚合酶、dNTP和DNA Ladder Marker购于美国 Promega公司，Bax抗体和Bcl-2 抗体购于美国Santa Cruz公司。

1.2 动物分组及颈椎稳定性异常小鼠模型制备 经水迷宫实验筛选，小鼠学习记忆能力无明显差异。将动物随机分为对照组和模型组，每组10只，分组后模型组造模，对照组未经任何处理。模型制备采用颈椎乳酸堆积法，于第一与第二颈椎关节囊被膜周围注射30%乳酸溶液，30μL/次，每周1次，连续注射3周[2]。以水迷宫实验结果判定模型制备是否成功。

1.3 水迷宫实验 水迷宫由黑色有机玻璃板制成，水深18 cm,水温(23±1)℃，分成A、B、C和D区，终点区有一个高出水平面的安全平台。各区至终点区为一个阶段训练,每阶段训练3次。每次到达平台上休息30 s，再行下次实验。小鼠从起点A区游至终点台阶处的时间为游全程时间,其进入盲端次数为错误次数，首次试验记录学习成绩；24 h复测记录记忆成绩。若动物120 s内未游到终点则以120 s计算。造模后观察小鼠一般状态，3个月后经水迷宫方法检测学习记忆能力有明显差异后处死小鼠取脑。

1.4 HE染色 甲醛固定后石蜡切片，HE染色，镜下观察细胞分布、形态、胞浆及染色质形态变化。

1.5 TUNEL染色 参照试剂盒进行TUNEL染色，阳性细胞呈现棕黄色，每只鼠脑染色2张切片，每张切片高倍视野(400×)下选取4个视野。每个视野内计数100个细胞，计算阳性细胞数，所有细胞数取平均值。

1.6 RT-PCR法检测脑海马Bcl-2和Bax mRNA表达 按Trizol试剂盒说明书操作提取总RNA,Oligo为引物进行逆转录合成cDNA。Bcl-2引物序列，上游引物：5′-TCGACCCTCTGGTGAGAA-AC-3′，下游引物：5′-AGGTAGGAGCTGAGGCATGA-3′，扩增片段为327 bp。Bax引物序列，上游引物：5′-CCAGGATGCGTCCACCAA-3′，下游引物：5′-CTGATCAGCTCGGGCACTTT-3′，扩增产物长度为312 bp。引物由上海生工公司合成。β-actin作为内参对照。2%琼脂糖凝胶电泳。计算Bcl-2与β-actin PCR产物吸光度容积之比值，作为Bcl-2和Bax的相对含量。实验重复3次。

1.7 免疫组织化学染色 采用SABC法对Bcl-2和Bax染色，按试剂盒说明书操作，细胞内见棕黄色颗粒为阳性细胞。

2 结 果

2.1 水迷宫实验 与对照组比较，模型组小鼠游全程时间明显延长,错误次数显著增加 (Plt;0.01)。见表1。

2.2 HE染色 镜下可见：对照组小鼠脑海马神经细胞形态规则、整齐，紧密排列3～4层；胞浆透明，细胞核呈圆形或椭圆形，染色质分布均匀，核仁清晰。模型组小鼠脑海马神经细胞层数减少，排列紊乱、稀疏；细胞脱失明显，胞体皱缩，其周围出现间隙；细胞核固缩，胞浆浓染，结构不清。表明颈椎失稳可致小鼠脑海马神经细胞损伤与死亡。见图1(插页二)。

表1 2组小鼠水迷宫实验检测结果

GroupLearningabilityEscapelatency(t/s)WrongtimesMemoryabilityEscapelatency(t/s)WrongtimesControl38．14±19．571．83±0．9849．33±28．054．17±1．94Model118．30±5．00∗14．00±4．18∗117．70±7．27∗13．70±3．27∗

*Plt;0.01 compared with control group.

2.3 TUNEL染色和半定量分析 与对照组比较，模型组小鼠脑海马阳性细胞明显增多,其胞核为均匀一致的棕褐色，并呈环指样结构，部分细胞其核外周可见棕黄色毛刷状结构(图1，见插页二)。半定量分析显示：对照组和模型组小鼠脑海马细胞凋亡率分别为7.52%±0.99%和29.63%±1.63%，二者比较差异有统计学意义(Plt;0.01)。

2.4 小鼠脑海马组织中Bcl-2和Bax mRNA表达 与对照组比较，模型组小鼠脑海马组织中Bcl-2 mRNA的表达强度明显减弱，Bax mRNA的表达强度明显增强。见图2。

图2 2组小鼠脑海马组织中Bcl-2和Bax mRNA表达

Fig.2 Expressions of the Bcl-2 and Bax mRNA in hippocampus of mice in two groups

2.5 小鼠脑海马组织中Bcl-2和Bax 蛋白表达 对照组小鼠脑海马组织中Bcl-2阳性细胞明显多于模型组。与对照组比较，模型组小鼠脑海马组织中Bax阳性细胞明显增多(图3，见插页二)。

3 讨 论

由脑缺血引发的认知功能障碍越来越引起人们重视，已有研究[9]表明：脑血流下降是导致及加速人类认知功能下降甚至痴呆的重要因素之一。因外伤、颈椎病等各种因素所导致的颈椎失稳可造成认知功能障碍，而通过手术纠正颈椎失稳对认知功能有明显改善作用[10]。

本研究利用30%乳酸注射环枢椎关节囊处软组织制备老龄小鼠颈椎失稳病理模型，经水迷宫实验检测，与对照组比较，模型组小鼠的学习记忆能力明显下降，其结果与本研究小组以往的实验结果相吻合[3-5]，说明颈椎失稳模型复制成功。

颈椎失稳会导致其关节发生渐进性的微错位,造成椎动脉机械性受压或扭曲，使椎-基底动脉缺血并刺激交感神经，后者又促进椎-基底动脉收缩，加重脑组织供血不足。脑缺氧及交感神经兴奋可因应激反应而致脑自由基堆积[5]，炎细胞激活，细胞因子(如TNFα、IL-1等)释放。自由基与细胞因子(主要是致炎因子)可通过多种途径而启动细胞凋亡程序导致细胞形态改变及凋亡[11]。本研究TUNEL染色结果显示：与对照组比较，模型组小鼠脑海马组织凋亡细胞数明显增多，说明颈椎失稳可促进老龄小鼠脑海马神经细胞凋亡。

脑细胞进行性丧失是导致神经系统疾病主要原因之一，引起神经元进行性丧失的主要机制是细胞凋亡。众所周知，脑缺血可引起细胞凋亡[12]，而Bcl-2族在凋亡信号转导中起着关键作用。Bcl-2族是最受重视的凋亡基因相关家族,包括促凋亡和抗凋亡两种蛋白[13]。抗凋亡的主要成员有位于线粒体外膜、内质网和核周膜的Bcl-2和Bcl-XL，其主要作用机制可能为： ①阻断钙离子的释出并阻断DNA消化和细胞凋亡[14]；②抑制氧自由基的产生或起一种抗氧化剂的作用,阻断细胞凋亡[15]；③作用于线粒体与核孔复合体上的信号分子,控制细胞信号转导来延长细胞生存[16]；④Bcl-2通过阻断凋亡最后基因通路(激活caspases)抑制凋亡[17]。Bax是整个Bcl-2家族中最主要的促凋亡蛋白，在促进凋亡、拮抗Bcl-2的同时通过影响线粒体膜的呼吸作用及葡萄糖氧化过程，引起细胞凋亡[18-19]。Bcl-2/Bax比值决定了细胞接受凋亡信号后细胞的存活与否,如果Bax占优势,细胞死亡；如Bcl-2占优势,则细胞存活[20]。本研究RT-PCR及免疫组织学结果均显示：与对照组比较，模型组脑海马神经元Bcl-2/mRNA水平与蛋白表达水平强度均明显减弱，而Bax表达强度则明显增强，表明颈椎失稳的老龄小鼠学习记忆能力下降，可能与脑海马神经元Bcl-2表达下调、Bax表达上调而致其细胞凋亡有关。

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*吉林大学白求恩医学院临床医学七年制2006级

ExpressionsofBcl-2andBaxinhippocampalneuronsofsenilemicewithcervicalvertebralinstability

ZHU Tong-tong1,2*,LIN Gui-miao1,3,FAN Wen-jing1,4,LIU Guang-yao2, ZHAO Li-hua1,ZHAO Li-jing1,ZHAO Li-juan1

(1. Department of Pathophysiology,Norman Bethune College of Medicine,Jilin University,Changchun 130021, China；2. Department of Orthopedics,China-Japan Union Hospital,Jinlin University,Changchun 130033, China;3.Urinary and Reproductive Center,School of Medical Science,Shenzhen University,Shenzhen 518061, China;4.Department of Basic Nursing,School of Nursing,Shanghai Traditional Chinese Medical University, Shanghai 201203,China )

ObjectiveTo discuss the expressions of the senile mice with cervical vertebral instability on Bcl-2 and Bax which related to neural apoptosis in hippocampal neurons,and to clarify the mechanism of reducing of learning and memory abilities induced by cervical vertebral instability in the senile mice .Methods20 ICR mice were selected and randomly divided into two groups.The cervical vertebral instability model was established by lactic acid accumulation for long time;the changes of learning and memory abilities of the mice were observed with Watermaze test; the changes of morphology in hippocampal neurons were observed by HE straining;the apoptosis of hippocampal neurons was observed by Tunel staining.The expression levels of mRNA and protein of Bax and Bcl-2 were detected by RT-PCR and immunohistochemical staining .ResultsCompared with control group,the escape latency and wrong times of Watermaze test in model group were increased(Plt;0.01) .The neuron in hippocampus in model group was found scatteredly and the dead cells were increased obviously observed with HE staining compared with control group.The Tunel staining results showed that there were more buffy cells in model group(29.63%±1.63%) than control group(7.52%±0.99%)(Plt;0.01).The expression of Bcl-2 was decreased and the Bax was increased in the brain tissue in model group compared with control group detected by RT-PCR and immunohistochemical staining.ConclusionThe cervical vertebral instability could lead to Bcl-2 decreasing and Bax increasing,and it might be one of the main mechanisms to promote the apoptosis.

cervical vertebral instability; hippocampus; Bcl-2; Bax; apoptosis

1671-587Ⅹ(2013)05-0884-04

10.7694/jldxyxb20130506

2013-04-12

国家自然科学基金资助课题(30870921)

朱彤彤(1987-)，男，吉林省长春市人，在读医学硕士，主要从事骨科相关疾病的研究。

刘光耀(Tel：0431-89876928，E-mail：guangyao0906@hotmail.com)；

R681.5

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