生物活性复合膜对大鼠牙周组织缺损的修复作用

林泓兵，赵 斌，丁子清，任春霞，林崇韬

(吉林大学口腔医院牙周病科，吉林 长春 130021)

生物活性复合膜对大鼠牙周组织缺损的修复作用

林泓兵，赵 斌，丁子清，任春霞，林崇韬

(吉林大学口腔医院牙周病科，吉林 长春 130021)

目的：联合应用胶原(Co)、聚乳酸/聚羟基乙酸共聚体(PLGA)、牙周膜细胞(PDLCs)和血小板胶(APG)制作生物活性复合膜，评价其对大鼠牙周组织缺损的修复效果。方法：合成厚度约0.5 mm的PLGA膜，与PDLCs体外共培养3 d。扫描电镜观察PLGA结构及PDLCs生长情况。选取1只成年雄性Wistar大鼠，抽取全血10 mL制作富血小板血浆(PRP) 1 mL，加入含有1 000 U·mL-1牛凝血酶的10% CaCl2溶液制成APG。应用酶联免疫吸附法测定全血和PRP中生长因子水平。将60只成年雄性Wistar大鼠随机分为5组，分别制作大鼠下颌牙周骨缺损模型(5 mm×2 mm，去除根面牙骨质)。各组按置入材料不同命名为对照组、PLGA+Co组、PLGA+APG+Co组、PLGA+PDLCs+Co组和PLGA+PDLCs+APG+Co组。术后2、4和6周每组分别处死4只大鼠，HE染色观察新生牙周骨量，应用Image-Pro Plus测量新生牙周骨面积。结果：PLGA膜平均孔径为(131.80±43.97) μm，孔隙率为60%；PDLCs能在PLGA膜上黏附生长、状态良好。PRP中血小板浓度高达全血的4倍以上，PRP上清液中生长因子水平高于血浆(Plt;0.05)。术后6周牙周新生骨量PLGA+PDLCs+APG+Co组分别高于PLGA+Co组、PLGA+APG+Co组和PLGA+PDLCs+Co组，差异有统计学意义(Plt;0.05)； PLGA+APG+Co组和PLGA+PDLCs+Co组高于PLGA+Co组(Plt;0.05)； PLGA+Co组、PLGA+APG+Co组、PLGA+PDLCs+Co组和PLGA+PDLCs+APG+Co组均高于对照组(Plt;0.05)；PLGA+APG+Co组与PLGA+PDLCs+Co组间比较差异无统计学意义(Pgt;0.05)。结论：PLGA膜生物相容性良好，孔径大小适宜，具有良好的机械性能；PLGA+PDLCs+APG+Co生物活性复合膜能促进牙周组织生长，对牙周骨组织缺损修复具有显著作用。

牙周膜细胞；胶原；聚乳酸/聚羟基乙酸共聚体；富血小板血浆；牙周组织再生

理想的牙周治疗效果是重建牙周组织生理结构和功能[1]。近年来组织工程学(tissue engineering)的迅速发展为治疗牙周组织缺损、实现再生修复提供了新的思路。目前相继报道关于胶原(collagen，Co)、聚乳酸/聚羟基乙酸共聚体(polylactic-co-glycolic acid，PLGA)、牙周膜细胞(periodontal ligament cells，PDLCs)和血小板胶(autologous platelet gel，APG)分别用于修复牙周组织缺损的研究[2-4]，但尚无将上述材料联合应用修复牙周组织缺损的报道。本研究依据组织工程学原理，联合应用Co、PLGA、PDLCs和APG制作生物活性复合膜，观察该复合膜修复牙周组织缺损的疗效，为其临床应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物、主要试剂和仪器 成年雄性Wistar大鼠60只，体质量160～180 g，由吉林大学实验动物中心提供[许可证号SCXK(吉)2008-0005]。成分为75∶25的PLGA粉末(中科院长春应用化学研究所)；Quanta 200 F场发射环境扫描电子显微镜(荷兰FEL公司)，MCV-80Q二氧化碳恒温细胞培养箱(美国ROYN公司)；低温高速离心机(美国Sigma公司)，超净台(苏州AIRTECH公司)；倒置显微镜(日本OLYMPUS公司)，Co(正海生物有限公司)，自动石蜡包埋机、组织切片机(德国Leitz公司)。

1.2 PLGA膜的合成及PLGA与PDLCs体外共同培养 将PLGA粉末均匀溶于二氧六环溶液中，加入直径大于200 μm的蔗糖制孔，制成厚约0.5 mm的PLGA膜。将制成的PLGA膜剪裁成5 mm×2 mm，经消毒及预湿后与PDLCs(接种密度为每孔5×103)在恒温细胞培养箱中培养3 d。扫描电镜观察PLGA结构及PDLCs生长情况。

1.3 APG的制备 大鼠腹主动脉采血10 mL，采用二次离心法制作富血小板血浆(platelet-rich plasma，PRP)约1 mL，计数PRP及全血血小板数。若PRP中血小板数为全血4倍以上，则PRP制取成功。加入含有1 000 U·mL-1牛凝血酶的10% CaCl2溶液，制成APG，切成5 mm×2 mm×0.5 mm大小备用。

1.4 全血和PRP中生长因子水平的测定 应用酶联免疫吸附法，按照试剂盒说明书操作，测定450 nm波长下的吸光度(A)值，计算全血血浆和PRP上清液中血小板衍生生长因子-AB(platelet- derived growth factor-AB,PDGF-AB)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的水平。

1.5 建立大鼠牙周骨缺损模型 将大鼠随机分为5组，按置入材料不同命名为对照组、PLGA+Co组、PLGA+APG+Co组、PLGA+PDLCs+Co组和PLGA+PDLCs+APG+Co组。麻醉大鼠，翻瓣暴露术区，用低速手机球钻在下颌距龈缘1 mm、距颏孔3 mm的区域，平行龈缘预备5 mm×2 mm的牙周骨缺损，并磨除牙根面牙骨质。对照组大鼠骨缺损内不放置任何材料；PLGA+Co组大鼠骨缺损内放置PLGA膜；PLGA+APG+Co组大鼠骨缺损内放置PLGA和APG；PLGA+PDLCs+Co组大鼠骨缺损内放置复合PDLCs的PLGA膜；PLGA+PDLCs+APG+Co组大鼠骨缺损内放置复合PDLCs的PLGA膜和APG。将Co膜裁成7 mm×4 mm大小，分别覆盖于除对照组外的其他4组缺损表面，缝合创口，术后连续3 d腹腔注射庆大霉素(1万U/300 g)。

1.6 HE染色 术后2、4和6周各组分别处死4只大鼠，切取下颌骨，置于4%的多聚甲醛液中固定。脱钙，浸蜡包埋，切片3 μm， HE染色观察各组大鼠新生牙周骨量。

1.7 新生牙周骨面积的测定 采用Image-Pro Plus图像分析软件对术后6周各组大鼠牙周组织HE染色结果进行图像分析，计算新生牙周骨面积。

2 结 果

2.1 扫描电镜观察PLGA结构及PDLCs的生长情况 PLGA膜孔径大小均匀，平均孔径为(131.80±43.97) μm，孔隙率为60%(图1A)。PDLCs黏附生长于PLGA，伸展性良好，可见细胞伪足(图1B)。

图1 扫描电镜观察PDLCs在PLGA上的黏附和生长情况

Fig.1 Adhesion and growth conditions of PDLCs on PLGA observed under SCM

A: Structure of PLGA;B: PDLCs pseudopod.

2.2 血小板计数结果 3次制备的PRP血小板计数均达到全血血小板计数的4倍以上，制备前后血小板计数比较差异有统计学意义(Plt;0.05)，证明PRP制备成功。

2.3 全血和PRP中生长因子水平 PRP上清液中PDGF-AB、bFGF和VEGF的表达水平明显高于血浆中的水平(Plt;0.05)，说明血小板活化后能释放大量生长因子。见表1。

表1 全血血浆和PRP上清中PDGF-AB、bFGF和VEGF的表达水平

Tab.1 Expression levels of PDGF-AB，bFGF and VEGF in PRP supernatant and whole blood plasma[n=18,±s,ρB/(mg·L-1)]

*Plt;0.05vsplasma.

2.4 各组大鼠新生牙周骨的组织学观察及新生牙周骨面积比较 术后2周实验组和对照组均可见大量纤维组织及炎性细胞，PLGA+Co组、PLGA+APG+Co组、PLGA+PDLCs+Co组和PLGA+PDLCs+APG+Co组支架材料周围可见巨噬细胞聚集;术后4周PLGA+Co组、PLGA+APG+Co组、PLGA+PDLCs+Co组和PLGA+PDLCs+APG+Co组新生微血管丰富，新生的牙周膜纤维排列杂乱；PLGA+PDLCs+APG+Co组可见新生牙槽骨和牙骨质样组织，新生组织及支架材料周围可见成骨细胞紧密排列；对照组可见少量微血管生成。术后6周PLGA+PDLCs+APG+Co组的新生牙槽骨和牙骨质样组织丰富，骨再生量和成熟度均高于其他组(图2A，见插页二)；PLGA+APG+Co组和PLGA+PDLCs+Co组有新生骨及胶原纤维束(图2B，见插页二)；PLGA+Co组可见新生骨，其周围紧密排列成骨细胞，膜材料未完全降解；对照组仅有少量新生骨，成熟度差且主要集中在骨缺损边缘。术后6周采用Image-Pro Plus 软件计算各组大鼠新生牙周骨面积，对照组、PLGA+Co组、PLGA+APG+Co组、PLGA+PDLCs+Co组和PLGA+PDLCs+APG+Co组新生牙周骨面积分别为(24 010.05 ±2 918.10)、(42 536.87±3 020.35)、(53 536.44±3 637.11)、(56 044.28±4 073.35)和(226 903.62±18 317.42) μm2，PLGA+PDLCs+APG+Co组新生牙周骨面积均高于PLGA+Co组、PLGA+APG+Co组和PLGA+PDLCs+Co组(Plt;0.05)；PLGA+APG+Co组和PLGA+PDLCs+Co组新生牙周骨面积均高于PLGA+Co组(Plt;0.05)；PLGA+Co组、PLGA+APG+Co组、PLGA+PDLCs+Co组、PLGA+PDLCs+APG+Co组新生牙周骨面积均高于对照组(Plt;0.05)；而PLGA+APG +Co组与PLGA+PDLCs+Co组比较差异无统计学意义(Pgt;0.05)。

3 讨 论

PDLCs是牙周组织再生的前体细胞，具有异质性和分化潜能，存在多种细胞亚群，当发生牙周炎或外界环境刺激时PDLCs通过增殖和分化，参与牙周膜和牙槽骨的改建，在牙周组织再生修复过程中发挥极为重要作用[5-7]。

APG中富含多种生长因子，主要包括PDGF和转化生长因子(transforming growth factor，TGF)[8]，PDGF可对多种细胞产生趋化作用[9]，TGF能协同PDGF对PDLCs的趋化、迁移作用[10]。

研究[11]表明：成骨的速度和支架材料降解的时间相关，材料降解为骨矿化提供了矿物基质，另一方面血管及各种细胞的爬入也加速材料的降解。通过预实验观察到术后6周大鼠牙周骨组织缺损重建最为活跃，为取得良好的修复效果，要求PLGA膜术后6周完全降解。PLGA的降解是酯键水解断裂成羟基和羧基的过程，降解过程中产生的羧基积累形成微酸性环境，加快PLGA的降解，这一现象被称为聚酯降解的“自加速”现象。由于“自加速”现象使得PLGA膜孔连通性越好、孔壁越薄、孔隙率越高，支架的降解速率越慢[12]。6～8周Wistar大鼠磨牙颊侧牙周骨壁较薄，平均为0.5 mm；有研究[13-16]表明：适合成纤维细胞生长的空间为180～200 μm，孔径大于100 μm时才能为成骨细胞提供最基本的生长环境。为了保证PLGA膜的机械强度，本研究将其制作成厚度为0.5 mm，孔隙率为60%[17]的PLGA膜。

本实验结果显示：由于加入PLGA+PDLCs+APG+Co生物活性复合膜，PLGA+PDLCs+APG+Co组新生牙周骨量多于PLGA+Co组、PLGA+APG+Co组和PLGA+PDLCs+Co组；未加入PDLCs的PLGA+APG+Co组和未加入APG的PLGA+PDLCs+Co组新生牙周骨量多于无PDLCs、APG的PLGA+Co组。APG的主要成分PDGF和TGF共同作用，能促进细胞及新生血管向支架材料生长，加速支架材料的降解[9-10]。PLGA+Co组6周时支架材料仍有部分未降解，也是因为未加入PDLCs和APG。

综上所述，本实验制备的PLGA+PDLCs+APG+Co生物活性复合膜具有显著的促进牙周组织生长的作用，其修复牙周骨组织缺损的效果优于PLGA、PDLCs、APG和Co其中一种或几种单独使用。本研究结果为生物活性复合膜的临床应用提供理论依据。

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Repaireffectofcomplexbiomembraneonperiodontaltissuedefectofrats

LIN Hong-bing,ZHAO Bin,DING Zi-qing,REN Chun-xia,LIN Chong-tao

(Department of Periodontology，Stomatology Hospital，Jilin University，Changchun 130021，China)

ObjectiveTo make complex biomembrane with collagen (Co),polylactic acid / polyglycolic acid copolymer (PLGA),periodontal ligament cells (PDLCs) and autologous platelet gel (APG) and to evaluate the repair effects on periodontal tissue defect of the rats,and to provide theoretical basis for their clinical application.MethodsSynthetic PLGA,human PDLCs and PLGA were co-culturedinvitrofor 3 d,10 mL whole blood of the rats was extracted to make platelet-rich plasma (PRP),and the growth factor levels in activated PRP and whole blood were detected.10%CaCl2including 1 000 U·mL-1bovine thrombin was added to make APG.60 Wistar adult male rats were randomly divided into 5 groups,and the mandible alveolar bone defect models were established (5 mm×2 mm，root cementums were struck off),the 5 groups were separately named control group,PLGA+Co group,PLGA+APG+Co group,PLGA+PDLCs+Co group,and PLGA+PDLCs+APG+Co group for the stuff placed into mandible alveolar bones’ defects.Then 4 rats in each group were exeacted at the 2nd week,the 4th week and the 6th week after operation,and HE staining was used to observe the quantity of new born bones.Image-Pro Plus was used to obtain the areas of new bones,and SPSS 13.0 was used for statistics analysis.ResultsThe average pore size of PLGA was (131.80±43.97) μm and the porosity was 60%.PDLCs stretched well on PLGA.The number of platelets in PRP were 4 times higher than those in whole blood and the growth factor levels in supernatant were higher than those in blood plasma.The quantity of new bones at the 6th week after operation in PLGA+PDLCs+APG+Co group was more than those in PLGA+Co group,PLGA+APG+Co group and PLGA+PDLCs+Co group(Plt;0.05);the quantities of new bones in PLGA+APG+Co group and PLGA+PDLCs+Co group were more than that in PLGA+Co group;the quantities of new bones in PLGA+Co group,PLGA+APG+Co group,PLGA+PDLCs+Co group and PLGA+PDLCs+APG+Co group were more than that in control group(Plt;0.05),but there was no significant difference between PLGA+APG+Co group and PLGA+PDLCs+Co group(Pgt;0.05).ConclusionThe pure size PLGA has excellent biocompatibility,suitable high porosity and good mechanical properties.PLGA+PDLCs+APG+Co complex biomembrane plays significant role in promoting periodontal tissue growth.

periodontal ligament cells;collagen;polylactic-co-glycolic acid;platelet-rich plasma;periodontal tissue regeneration

1671-587Ⅹ(2013)05-0888-05

10.7694/jldxyxb20130507

2012-11-02

吉林省科技厅科技发展计划重点项目资助课题(20090446)

林泓兵(1986-)，女，吉林省长春市人，医学硕士，主要从事口腔牙周病学基础与临床研究。

林崇韬(Tel：0431-88796039，E-mail：linct@jlu.edu.cn)

R783.1

A