云南白药和碘仿在大鼠腭裂手术中的应用及效果比较

梁乃银，邹永巍，张红玲

(1.吉林大学口腔医院急诊科,吉林 长春130021；2.吉林大学口腔医院口腔颌面外科，吉林 长春130021)

云南白药和碘仿在大鼠腭裂手术中的应用及效果比较

梁乃银1，邹永巍2，张红玲1

(1.吉林大学口腔医院急诊科,吉林 长春130021；2.吉林大学口腔医院口腔颌面外科，吉林 长春130021)

目的：探讨在大鼠腭裂手术术中和术后应用云南白药和碘仿对伤口愈合的效果，寻找更适合于大鼠腭裂手术术中和术后应用的药物。方法：将90只SD大鼠随机分为对照组、碘仿组和云南白药组，每组30只。通过手术方法在大鼠硬腭部制作腭裂缺损，并根据分组在缺损中填塞云南白药或碘仿4 mg，对照组不填药物。术后应用肛门测温法测定大鼠体温，应用骨密度仪检测腭部手术区骨密度，HE染色和改良gomori特殊染色法观察新骨形成情况，免疫组织化学法检测碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和骨形态发生蛋白2(BMP2)表达水平。结果：术后1周碘仿组大鼠体温高于其他2组(Plt;0.05)；术后第2、3周X射线片显示云南白药组骨密度高于其他2组(Plt;0.05)；HE染色及改良Gomori特殊染色观察到云南白药组成纤维细胞分裂、增殖和新骨形成情况明显强于对照组和碘仿组；术后第2、3周云南白药组bFGF和BMP2表达水平高于其他2组(Plt;0.05)。结论：腭裂手术大鼠应用云南白药对体温无刺激性升高，而且能够促进成纤维细胞增殖，减少术后腭瘘并发症的发生，同时能够促进腭裂的骨性修复。

大鼠，Sprague-Dawley;腭裂；云南白药；碘仿；骨性愈合

腭裂是一种常见的先天性畸形，需要手术修复腭部的解剖形态,恢复腭部的生理功能[1]。传统的腭裂修复术在两侧松弛切口内填塞碘仿纱条,以达到减张、止血和防止感染的目的。但郭秀娟等[2]研究表明：在松弛切口内填塞碘仿纱条的患者术后愈合情况不及未填塞的患者。云南白药具有促进血小板凝聚、收缩血管及促进糖皮质激素分泌作用，对炎症过程的介质释放、毛细血管渗透性增强、结缔组织增生等环节具有抑制作用。姜文[3]在腭裂修复手术中应用云南白药粉末,均匀撒于无菌油纱条上,用该纱条填塞于松弛切口推断翼钩的创口内及翻瓣后渗血处，用以防止术后出血，取得了良好的临床疗效。本研究拟通过人工制造腭裂骨缺损大鼠模型，术中应用云南白药、碘仿，经过测量体温、X射线检查、HE染色、改良gomori特殊染色、免疫组织化学检测碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)和骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein-2,BMP2)表达的方法，探讨云南白药和碘仿在大鼠腭裂术后愈合中的作用，以期发现更适合在腭裂手术中应用的药物。

1 材料与方法

1.1 实验动物 90只4月龄SD大鼠，体质量(300±10) g，购于吉林大学动物实验中心，动物合格证号：2009-0001。

1.2 主要试剂和仪器 云南白药由云南白药股份公司生产，碘仿由天津市化学试剂厂生产，bFGF和BMP2多克隆抗体及SABC即用型免疫组织化学试剂盒购于北京中杉生物公司;BMD400E 型骨密度仪由吉林大学第四医院提供，石蜡切片机(Thermo公司，德国)由吉林大学口腔医院提供。

1.3 实验动物分组及造模方法 将大鼠随机分为对照组、碘仿组和云南白药组，每组30只。水合氯醛腹腔注射麻醉,暴露大鼠上腭(腭部前3/4为硬腭,后1/4为软腭)。根据邹永巍等[4]的大鼠腭裂模型的制作方法：75%酒精棉球消毒大鼠口腔，在大鼠硬腭中间部,用手术刀切除长度为7.0 mm、宽度为2.5 mm的腭黏膜,暴露腭骨，选钻头直径为2.0 mm的电动骨钻去除暴露出的腭骨，去骨深度为2.0 mm、长度为7.0 mm、宽度为2.5 mm (图1，见插页三)，保留鼻腔黏膜的完整性[5]。剥离子潜行分离创口处腭黏膜，以备拉拢缝合。在所制备的骨缺损内,根据不同的分组,分别放入云南白药4 mg、碘仿4 mg，对照组不放任何药物，用000缝线间断缝合创口。术后1周测量大鼠体温,观察大鼠活动及饮食情况。

1.4 骨密度测量 于术后2周，各组取出10只大鼠。麻醉后颈内动脉灌注40℃生理盐水，排净血液后灌注4%多聚甲醛溶液。当颈内静脉断端流出透明液体，大鼠舌头变硬，停止灌注。取下上颌骨，放入4%多聚甲醛中固定3 d。薄片锯切割腭骨，形成10 mm×10 mm×3 mm大小标准腭骨块(图2，见插页三)。按照该方法，术后第3周和第4周末，各取出10只大鼠制作标准腭骨块。采用BMD400E型骨密度仪测量3组标准骨块的骨面密度(BMC/BW)值。

1.5 组织切片染色观察新骨形成情况 先用甲酸氯化铝脱钙液将标准骨块脱钙3 d，然后换成20%EDTA脱钙2周[6]。以标本在大鼠口腔中冠状面为石蜡切片面进行切片，每蜡块切片5张。每只大鼠一张石蜡切片进行HE染色。选取另一张切片(与HE染色对应)行改良gomori特殊染色[7]。经特殊染色，纤维组织被染成浅红色，胶原及软骨组织被染成蓝色，骨组织及新生类骨质被染成绿色。在显微镜下观察手术区新骨形成情况。

1.6 免疫组织化学二步法检测bFGF和BMP2 将剩余石蜡切片按组别分别进行bFGF和BMP2免疫染色，并设置免疫染色对照组。免疫组织化学染色阳性判定标准：细胞内染色以细胞中出现棕黄色颗粒为染色阳性；细胞外染色以细胞间基质中出现片状棕黄色为染色阳性。在同一显微镜和图像分析系统下，利用Image-pro 6.0分析软件，测定bFGF和BMP2阳性染色吸光度(A)值，以A值表示bFGF和BMP2表达水平。

2 结 果

2.1 各组大鼠术后体温变化 第1周每天上午8：00-11：00 测量大鼠肛门体温。腭裂术后3组大鼠体温均有不同程度升高，碘仿组大鼠体温明显高于云南白药组和对照组(Plt;0.05)。术后第3天，云南白药组大鼠和对照组大鼠体温均下降，而碘仿组大鼠体温明显升高，个别大鼠最高体温达到40℃。见表1。

表1 大鼠腭裂术后1周体温变化

*Plt;0.05 compared with control group.

2.2 各组大鼠术后腭裂愈合情况 术后第7天大鼠腭部伤口拆线。云南白药组大鼠腭部伤口愈合皆良好，未出现明显的红肿及感染化脓现象。碘仿组大鼠腭部伤口红肿，但无感染化脓。对照组大鼠腭部伤口愈合不良，伤口水肿严重，有3只大鼠伤口感染化脓。术后第2周，云南白药组1只大鼠腭部伤口形成腭瘘，口腔鼻腔相通，瘘孔直径约1.5 mm；碘仿组3只大鼠形成腭瘘，瘘孔直径约2.5 mm；对照组5只大鼠形成腭瘘，平均瘘孔直径3.0 mm。

2.3 骨密度测量结果 术后第2周，3组大鼠骨密度值无明显差别；术后第3周和第4周，云南白药组大鼠骨密度高于其他2组(Plt;0.05)。见表2。

表2 骨密度测量结果

Tab.2 Determination results of bone mineral density

GroupBonemineraldensity(t/week) 234Control0．328±0．0230．357±0．0250．396±0．018Iodoform0．324±0．0260．354±0．0160．398±0．021Baiyao0．327±0．0180．397±0．027∗0．441±0．019∗

*Plt;0.05 compared with control group.

2.4 HE染色结果 术后第2周，3组大鼠腭部缺损均为纤维结缔组织填充，由大量平行或交错分布的胶原纤维束组成，纤维束呈均匀玻璃样变。云南白药组在缺损部位的外侧缘可见类骨和成骨细胞，透明软骨形成；碘仿组和对照组无明显的成骨活动；对照组部分区域可见轻微炎性反应，有散在淋巴细胞和巨噬细胞。术后第3周，云南白药组缺损两端有新生骨小梁向中间延伸，有明显类骨及成骨细胞，形成骨性骨痂(图3A，见插页三)，成骨细胞多位于成骨活跃部位，胞体呈扁椭圆形，核较大，呈椭圆状，染色较深；碘仿组缺损两侧缘也有新生骨小梁和成骨细胞，但其中央部位仍为大量成纤维细胞和胶原纤维组织(图3B，见插页三)。术后4周，云南白药组缺损区均为骨性骨痂填充，主要为板层骨，有骨陷窝存在，与周围正常骨组织分界不清；碘仿组和对照组骨形成量增加，但是仍可见部分纤维性骨痂。

2.5 改良gomori特殊染色结果 术后第2周，云南白药组缺损区被大量的胶原纤维充填，其中可见到被染成红色的骨母细胞，周围毛细血管丰富；碘仿组可见到大量成纤维细胞，胞核蓝染，无明显新骨形成(图4A，见插页三)。术后第3周，云南白药组可见缺损红染部分减少，被绿染的新生骨组织所代替(图4B，见插页三)；碘仿组和对照组蓝染和红染的部分仍然较多。术后第4周，云南白药组骨组织呈连续性，骨膜完整，接近正常组织；碘仿组和对照组缺损未完全被骨组织充填，绿染不均匀。

2.6 bFGF染色检测结果 大鼠腭裂术后第2～4周,云南白药组大鼠腭骨组织bFGF表达水平高于碘仿组(Plt;0.05)，云南白药组和碘仿组大鼠腭骨组织bFGF表达水平高于对照组(Plt;0.05)。见表3。

2.7 BMP2染色检测结果 大鼠腭裂术后第2和3周，云南白药组大鼠腭骨组织BMP2表达水平高于对照组(Plt;0.05)，碘仿组和对照组之间比较差异无统计学意义(Pgt;0.05)。术后第4周，3组大鼠腭骨组织中BMP2表达水平比较差异无统计学意义(Pgt;0.05)。见表4。

表3 免疫组织化学法检测bFGF表达水平

Tab.3 Expression level of bFGF detected with immunohistochemical method(n=30,±s)

*Plt;0.05 compared with control group.

表4 免疫组织化学法检测BMP-2表达水平

Tab.4 Expression level of BMP2 detected with immunohistochemical method(n=30,±s)

*Plt;0.05 compared with control group.

3 讨 论

本研究结果显示：腭裂术后大鼠应用碘仿组与其他2组在体温变化上存在显著差别,云南白药组和对照组术后第4天体温接近正常，而碘仿组1周后体温仍然高于正常;大鼠手术后体温最高值也存在差别，云南白药组和对照组最高体温未超过39.5℃，而碘仿组的大鼠最高体温达到40℃。碘仿作为发热激活物作用于免疫细胞，可使其产生和释放内生致热原，再经一系列环节引起体温升高[8]。

腭黏膜在手术损伤后就有血管和炎症反应发生，凝血连锁反应被激活。云南白药可以明显促进凝血反应，并导致血小板黏附和聚集成团[9]。在本实验中，腭裂术后应用云南白药组大鼠腭部缺损区成纤维细胞增殖活跃。成纤维细胞在伤口愈合中扮演着重要角色[10]，成纤维细胞的增殖与迁移受到一系列调节因子的调节(如FGF及TGF-β)。本研究中免疫组织化学检测结果显示：云南白药组bFGF明显高于其他2组。成纤维细胞成熟后可以合成弹性蛋白、纤维黏连素、黏多糖和胶原酶，这些成分在伤口愈合的后期及伤口的重新塑形中发挥重要的作用。成纤维细胞与血管一起分化形成平滑肌细胞，在伤口收缩过程中发挥作用。黏多糖是一种多聚糖复合物，在肉芽组织早期反应中起重要作用[11]。胶原形成增加了腭黏膜的抵抗能力，防止腭瘘的发生。随着胶原量的相应增加，伤口的抗拉能力逐渐增强。故本研究中应用云南白药组大鼠腭瘘的发生率也明显低于其他2组。

在诸多治疗骨伤的中药中，由三七、乌头、重楼等组成的云南白药对骨伤治疗有着独特的疗效。杨庆秋等[12]在云南白药促进骨缺损修复及引导性骨再生的动物实验中发现：云南白药对骨缺损修复及引导性骨再生有明显的促进作用，这种诱导作用主要通过诱导因子对骨修复改建起重要作用[13]。许多研究[14]表明：骨诱导因子对骨组织的形成分化起决定性作用。在本实验中免疫组织化学检测BMP-2结果显示：术后第2和3周，云南白药组BMP-2局部水平均明显高于其他2组。研究[15]表明：BMP-2在体内能够诱导新骨形成，并在体外实验中对骨髓基质细胞也有着强烈的骨诱导活性，而且可以使诱导的骨细胞向确定性骨细胞转化。云南白药通过促进骨髓基质细胞产生BMP等因子，从而诱导骨髓基质细胞向成骨细胞转化，促进骨愈合。

在人的腭裂手术中，一般在松弛切口中常规放置碘仿纱条，以起到止血和减张的作用。该方法在临床上已应用多年，成为常规治疗方法。云南白药同样也可以制成云南白药纱条，而且制作简便。将云南白药均匀涂于油纱条上，就可制成云南白药纱条。云南白药应用于腭裂手术，避免了碘仿的一些不良反应。本实验中应用云南白药组大鼠术后体温变化与对照组基本相似，说明云南白药无像碘仿成为致热原，使大鼠体温明显增高，云南白药也无碘仿强烈的刺激性气味。腭裂手术填塞碘仿纱条的一个重要目的是止血。本实验结果显示：云南白药的止血作用明显优于碘仿，同时抗菌消炎作用也不比碘仿逊色。重要的是云南白药可以促进伤口的愈合，加快胶原纤维的合成，使腭裂伤口抗张能力明显增强，腭瘘的发生率也就相应降低。同时，云南白药可以促进BMP-2等骨形成诱导因子，从而促进成骨。

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ComparisonofcurativeeffectsbetweenYunnanBaiyaoandiodoformappliedinratsaftercleftpalateoperation

LIANG Nai-yin1,ZOU Yong-wei2,ZHANG Hong-ling1,

(1.Department of Emergency,Stomatology Hospital,Jilin University,Changchun 130021,China; 2.Department of Oral and Maxillofacial Surgery,Stomatology Hospital, Jilin University,Changchun 130021,China)

ObjectiveTo study the effects of Yunnan Baiyao and iodoform for rat cleft palate operation,and to find more suitable drug for the cleft palate operation.Methods90 SD rats were randomly divided into control group,drug iodoform group,and Yunnan Baiyao group;there were 30 rats in each group.Through the method of operation,the rat cleft palate defects models were set up.According to the grouping,the 4 mg Yunnan Baiyao or 4 mg iodoform werer put into the defects,and nothing in control group.The body temperature of the rats was detected with anal temperature measurement.Bone density meter was used to detect the palate operation area bone density.HE staining and modified Gomori staining were used to observe new bone formation.The contents of bFGF and BMP2 were determined by immunohistochemical method.ResultsThe body temperature of the rats in iodoform group was higher than those in the other two groups 1 week after operation (Plt;0.05).The X-ray detection results showed that the bone density in Yunnan Baiyao group was higher than those in the other two groups 2 and 3 weeks after operation(Plt;0.05).The fibroblast division,proliferation and new bone formation were enhaced in Yunnan Baiyao group by HE and modified Gomori special staining.The contents of bFGF and BMP2 in Yunnan Baiyao group were higher than those in the other two groups 2 and 3 weeks after operation(Plt;0.05).ConclusionYunnan Baiyao has no irritation to temperature,and it can not only promote the cleft palate soft tissue healing,but also reduce palatal fistula complications,and it can promote the bony repair of cleft palate.

rats,sprague-dawley;cleft palate;Yunnan Baiyao;iodoform;bone healing

1671-587Ⅹ(2013)05-0893-05

10.7694/jldxyxb20130508

2013-03-11

吉林省科技厅科研基金资助课题(20030539)

梁乃银(1982-)，男，天津市人，医师，医学硕士，主要从事口腔颌面部畸形治疗的研究。

邹永巍(Tel：0431-85579325,E-mail：neag@163.com)

R782.2