硼替佐米通过内质网应激途径增强力达霉素对人多发性骨髓瘤细胞SKO-007凋亡诱导作用

甄永占，纪春梅，赵毓芳，闫 丰，刘学军，王梅梅，徐爱军

（1.河北联合大学基础医学院组织学与胚胎学教研室，河北 唐山 063000；2.河北省唐山市协和医院呼吸内科，河北 唐山 063000；3.河北联合大学附属医院肿瘤科，河北 唐山 063000）

目前多发性骨髓瘤仍然不可治愈。在硼替佐米（bortezomid，BZM）等新药出现之前，多发性骨髓瘤患者中位生存期仅3年。但BZM不能根治多发性骨髓瘤，且随着其临床应用范围的扩大和时间的推移，部分患者对BZM产生了耐药反应，因此人们积极寻找新的抗多发性骨髓瘤药物、或者寻找以BZM为基础的联合治疗方案等以进一步提高多发性骨髓瘤患者的生存率和治愈率[1－2]。力达霉素（lidamycin，LDM）是大分子肽类抗肿瘤抗生素，大量研究[3－7]表明：LDM 具有较强的抗肿瘤活性，前期结果[7]证实：LDM具有抗多发性骨髓瘤作用，目前国内外尚无关于LDM联合BZM抗多发性骨髓瘤研究的报道，本研究探讨了LDM联合BZM抗多发性骨髓瘤的作用，为今后两药联合在多发性骨髓治疗中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞、主要试剂和仪器 鼠骨髓瘤细胞SKO-007由本室传代保存。RPMI1640培养液（美国Gibco公司），LDM由中国医学科学院医药生物技术研究所甄永苏院士惠赠，蛋白定量试剂盒（BCATM protein assay kit，美国 Pierce公司），宽范围蛋白预染 Marker（美国New England Biolabs公司），蛋白质印迹发光液和PVDF膜（美国 Millipore公司），Actin抗体（sc-1616，美国Santa Cruz公司），辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔、兔抗羊和羊抗小鼠IgG抗体（北京中杉金桥有限责任公司），凋亡相关分子抗体试剂盒、内质网应激相关分子抗体试剂盒、MAPK家族成员抗体试剂盒和磷酸化MAPK家族成员抗体试剂盒（美国 Cell Signaling Technology 公司）；Spectra Max 190酶标仪（美国 Molecular Device公司），伯乐电泳转印系统（美国Bio-Rad公司），Chemilmager 5500凝胶成像系统（美国Alpha Innotech公司）。

1.2 MTS法检测细胞存活率 MTS是MTT的一种新型类似物，化学名为3-（4，5-二甲基噻唑－2－磺）-5-（3-羧甲基氧苯基）-2-（4-磺苯基）-2氢四唑内盐。原理是MTS在 吩嗪硫酸甲酯（phenazine methosulfate，PMS）存在的情况下可被活细胞内的脱氢酶类还原，转化成液态可溶的产物，而死细胞无此功能，该水溶物可用酶标仪在波长490nm处检测，测定在490nm波长处的光吸收度（A）值，该值可间接反应活细胞的数量和活性。采用含10%胎牛血清（Hyclone）的RPMI1640培养液于37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养SKO-007细胞，2d传代1次。取对数生长期的SKO-007细胞，轻轻吹打分散成细胞悬液，记数后以1×104个细胞/孔的密度接种细胞于96孔细胞培养板中，2h后随机分为对照组、BZM组、LDM组、LDM＋BZM联合组；BZM组加入10nmol·L－1BZM，LDM 组加入0.5nmol·L－1LDM，LDM＋BZM 联合组加入10nmol·L－1BZM和0.5nmol·L－1LDM，药物处理48h，每组至少3个平行孔。每孔加入20LMTS和PMS混合液（按说明书配制：每2mL MTS溶液中加入100LPMS，现用现配），37℃继续培养1～4h，用酶标仪于490nm处测定每个孔A490值。实验设无药对照孔和无细胞对照孔各3孔，按下面公式计算细胞的存活率：细胞存活率＝（加药组A490值－空白组A490值）/（对照组A490值－空白组A490值）×100%。实验重复3次。

1.3 流式细胞术检测细胞周期分布 细胞经药物处理后，收集细胞，加入冰冷的磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）将细胞轻轻吹打成单个细胞，离心，PBS洗2次，用约500μL PBS重悬细胞，一边振荡一边加入5mL预冷的70% 乙醇，4℃ 固定过夜（如不及时测定，可放－20℃ 保存2周）。染色前细胞用PBS洗2遍，沉淀重悬于 PI染液中（50mg·L－1PI＋200g·L－1RNase A），37℃避光染色30min。细胞经200目尼龙网过滤后，采用流式细胞术测定DNA水平并分析细胞周期变化，结果以各个细胞周期所占的百分率表示。

1.4 Annexin V-FITC/PI法分析细胞凋亡 细胞经药物处理后，收集细胞，并用冰冷的PBS洗涤，将待测细胞数调整为（5～10）×108L－1，取1mL细胞于4℃、1 000r·min－1离心10min，弃上清液，PBS洗涤，将细胞重悬于300μL binding buffer中，加入Annexin V/FITC 10μL，轻轻摇匀，室温反应1h，加入PI 5μL轻轻摇匀，室温反应15min，细胞经200目尼龙网过滤后，在流式细胞检测仪上进行检测，结果以凋亡率表示。

1.5 蛋白质提取和 Western blotting检测 收集不同药物作用48h及未加药处理的SKO-007细胞，用预冷的1×PBS洗3次，加入新鲜配制的细胞裂解液（50mmol·L－1Tris-HCl，pH 7.5；1%NP-40；150mmol·L－1NaCl；1mmol·L－1Na3VO4；1mmol·L－1NaF，临用时加入3种蛋白酶抑制剂：1% 抑蛋白酶肽、10g·L－1亮抑酶肽、1mmol·L－1苯甲基磺酰氟）100μL，细胞与裂解液充分混合，冰浴20min。于4℃、13 000r·min－1离心15min，收集上清液于新的微量离心管中，采用BCA法测定蛋白水平。取各样品等量总蛋白30μg加入0.25倍体积的5×上样缓冲液，煮沸变性5min后，在10%十二烷基磺酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）胶上进行电泳。然后转移到硝酸纤维素膜上，1%BSA封闭1h，一抗4℃孵育过夜后，加相应二抗孵育2h，膜上滴加化学发光增强剂（Santa Cruz biotechnology SC-2048），按照试剂说明进行操作，结果在凝胶成像仪上照相并使用Bio-Rad公司Quantity One分析软件测量条带灰度值，目的条带与β-actin条带灰度值比值即为该目的蛋白的相对表达量。

1.6 统计学分析 采用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析。各组细胞存活率和细胞凋亡率以（±s）%表示，各组细胞凋亡相关蛋白、内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）相关蛋白表达量以±s表示，组间比较采用单因素方差分析。

2 结 果

2.1 各组细胞存活率 SKO-007细胞给药48h后，LDM＋BZM联合组细胞存活率明显低于

LDM组和BZM组；LDM组细胞存活率亦降低，

与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；LDM＋BZM联合组细胞存活率进一步降低，与LDM组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 各组SKO-007细胞存活率Tab.1 Survival rates of SKO-007cells in various groups[n＝3，η/（±s）%]

表1 各组SKO-007细胞存活率Tab.1 Survival rates of SKO-007cells in various groups[n＝3，η/（±s）%]

＊ P＜0.05 vs control group；△ P＜0.05 vs LDM group；＃P＜0.05 vs BZM group.

Group Cell survival rate Control 100.0±0.0 BZM 98.3±1.2 LDM 81.5±5.3＊BZM combined with LDM 42.9±3.1＊△＃

2.2 各组细胞周期分布 SKO-007细胞给药48h后，BZM组细胞周期的分布无明显变化，而LDM组细胞发生G2/M 期阻滞（61.16%），与对照组（17.99%）比较差异有统计学意义（P＜0.05）；LDM＋BZM联合组细胞G2/M期阻滞更加明显（82.21%），与LDM 组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见图1（插页五）。

2.3 各组细胞凋亡率 与对照组（4.1%±0.6%）比较，BZM 组细胞凋亡率（4.3%±0.7%）无明显变化；而LDM组细胞凋亡率（25.3%±1.9%）高于对照组和BZM 组（P＜0.05）；且LDM＋BZM联合组细胞凋亡率（38.3%±2.9%）高于其他3组（P＜0.05）。见图2。

2.4 各组细胞凋亡相关蛋白的表达量 与对照组比较，BZM 组的多聚二磷酸腺苷－核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase， PARP） 和caspase-3的切割片段蛋白表达量无明显变化；LDM组PARP和caspase-3的切割片段蛋白表达量高于对照组和BZM 组，BZM＋LDM联合组PARP和caspase-3的切割片段蛋白表达量高于BZM组、LDM 组和对照组（P＜0.05）。见图3和表2。

2.5 各组细胞ERS相关蛋白的表达量 BZM组和LDM组GRP78/Bip、CHOP/GADDl53和磷酸化JNK（p-JNK）蛋白表达量高于对照组，LDM组 GRP78/Bip、CHOP/GADDl53和 p-JNK 蛋白表达量高于BZM组，BZM＋LDM联合组细胞GRP78/Bip、CHOP/GADDl53 蛋 白 表 达 量 和p-JNK表达量高于BZM 和 LDM 组（P＜0.05）。见图4和表3。

图2 各组SKO-007细胞凋亡率Fig.2 Apoptotic rates of SKO-007cells in various groups

图3 Western blotting法检测各组SKO-007细胞凋亡相关蛋白的表达水平Fig.3 Expression levels of proteins associated with apoptosis in SKO-007cells detected by Western blotting method in various groups

表2 各组SKO-007细胞中凋亡相关蛋白的表达水平Tab.2 Expression levels of proteins associated with apoptosis in SKO-007cells in various groups（n＝3，±s）

表2 各组SKO-007细胞中凋亡相关蛋白的表达水平Tab.2 Expression levels of proteins associated with apoptosis in SKO-007cells in various groups（n＝3，±s）

＊ P＜0.05 vs control group；△ P＜0.05 vs LDM group；＃P＜0.05 vs BZM group.

Group Light densit y PARP/β-actin caspase-3/β-actin Control 0.063±0.004 0.031±0.002 BMZ 0.081±0.007 0.056±0.006 LDM 0.183±0.009＊＃ 0.175±0.009＊＃BZM combined with LDM 0.686±0.015＊△＃ 0.536±0.013＊△＃

3 讨 论

尽管对多发性骨髓瘤的生物学研究取得了长足进展，对于绝大多数患者来说其仍然是一种难以治愈的致死性疾病。

LDM属于烯二炔类抗生素，可诱导DNA单、双链的断裂。大量研究[3－7]表明：LDM具有较强的抗肿瘤活性。BZM是首个用于临床的蛋白酶体抑制剂，2003年5月美国食品药物管理局（FDA）批准BZM用于治疗多发性骨髓瘤患者。

表3 各组SKO-007细胞中ERS相关蛋白的表达水平Tab.3 Expression levels of proteins associated with ERS in SKO-007cells in various groups（n＝3，±s）

表3 各组SKO-007细胞中ERS相关蛋白的表达水平Tab.3 Expression levels of proteins associated with ERS in SKO-007cells in various groups（n＝3，±s）

＊ P＜0.05 vs control group；△P＜0.05 vs LDM group；＃P＜0.05 vs BZM group.

y-actin Control 0.083±0.006 0.008±0.003 0.182±0.006 Group Light densit GRP78/Bip/β-actin CHOP/GADDl53/β-actin JNK/β BMZ 0.166±0.008＊ 0.098±0.002＊ 0.346±0.009＊LDM 0.327±0.013＊＃ 0.172±0.004＊＃ 0.694±0.053＊＃BZM combined with LDM 0.538±0.024＊△＃ 0.475±0.038＊△＃ 0.986±0.051＊△＃

本研究结果显示：BZM能增强LDM对骨髓瘤细胞的增殖抑制、周期阻滞和凋亡诱导作用。

细胞发生凋亡的过程中，caspase家族蛋白酶在凋亡信号传导中起着关键性的作用。为了保持凋亡程序的正常进行，caspase在细胞中最初是以前体形式存在的。当起始caspases（initiator caspases）如caspase-8和caspase-9通过形成寡聚体被激活后，就可以切割效应caspase（effector caspases），如 caspase-3、caspase-6 和 caspase-7。激活的效应caspase反过来又可以切割一系列特异的细胞底物，caspase的最主要的底物是PARP，该酶与DNA修复、基因完整性监护有关联。在细胞凋亡启动时，相对分子质量为116 000的PARP被剪切成相对分子质量为31 000和85 000这2个片段，结果使受PARP负调控影响的核酸内切酶的活性增高，裂解核小体间的DNA，引起细胞凋亡。本研究结果显示：BZM和LDM两药联合进一步增加了SKO-007细胞caspase-3和PARP的切割片段蛋白表达量。因此可以推断BZM能够通过调控caspase家族增强LDM对SKO-007细胞的凋亡诱导作用。

内质网（endoplasmic reticulum，ER）是真核细胞中的重要细胞器，是蛋白质合成、翻译后修饰、折叠、寡聚化而形成正确构象和分泌的场所。ER对细胞内外环境的改变非常敏感，多种因素如氧化应激、Ca2＋平衡紊乱、缺氧、ATP耗竭、新合成蛋白质异常增多或加工、修饰和转运障碍等均可以导致ER内未折叠或错误折叠蛋白质的聚集和钙稳态失衡，出现 ERS[8－10]。ERS时内质网腔内蛋白不能正确折叠而大量滞留，导致未折叠蛋白反应（unfolded protein response，UPR）。一定程度的 UPR 可诱导葡萄糖调节蛋白类（glucose.regulated proteins，GRPs）、钙 网 蛋 白（calreticulin，CRT）和蛋白质折叠酶等ER伴侣分子表达上调，增强ER处理未折叠蛋白的能力，促进ER功能恢复；ERS持续存在或过强时将诱导CHOP/GADDl53、caspase-12和JNK等促凋亡因子的表达或活化，触发ER相关性凋亡信号途径，诱导细胞凋亡[11]。本研究结果显示：BZM能够增强LDM对SKO-007细胞的凋亡诱导作用，其机制与两药联合进一步增加细胞ERS标记分子GRP78/Bip和CHOP/GADDl53的表达以及进一步激活JNK有关。

综上所述，BZM能增强LDM的抗骨髓瘤作用，这种增强作用是通过进一步激活ERS蛋白，从而触发ERS相关凋亡信号途径，诱导细胞凋亡实现的。本研究为LDM联合BZM抗多发性骨髓瘤的体内实验和临床试验研究提供了理论依据。

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