牛磺酸对染矽尘大鼠肺泡巨噬细胞TNF－α表达的影响及其凋亡抑制作用

陈 静，李 明，李 超，赵 杰

（河北联合大学生命科学学院生物科学系，河北 唐山 063000）

矽肺是由于长期吸入大量含结晶型游离二氧化硅（SiO2）的岩尘所引起的尘肺病，是我国目前常见的且危害较为严重的职业病，是一种过量石英粉尘导致以肺部弥漫性纤维化为主的全身性疾病，危害人类健康。肺泡巨噬细胞（alveolar macrophage，AM）是尘肺发病的靶细胞，AM吞噬大量粉尘颗粒后被激活，继而释放活性氧和细胞因子等大量细胞活性物质，造成肺泡上皮细胞等肺泡结构受损，进而导致肺组织发生纤维化[1]。肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）在尘肺的早期炎症反应和最终尘肺纤维化的发生过程中发挥重要作用[2]。大量凋亡基因的表达引起AM

凋亡，AM凋亡是肺纤维化的病理学基础[3]。牛磺酸是一种含硫的非蛋白氨基酸，具有强肝利胆、抗炎、降压和提高机体免疫力等多种生理功能。近年来研究[4]表明：牛磺酸具有一定的抗纤维化作用，

然而牛磺酸在矽肺的发生发展过程中所发挥的重要作用及其作用机理在国内外尚未见报道。本研究以染矽尘大鼠为模型，探讨牛磺酸对大鼠AM凋亡的影响及其可能作用机制，以期为临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康成年雄性SD大鼠24只，清洁级，体质量240～280g，由河北联合大学实验动物中心提供。动物生产许可证号：SCXKA（京）2009-0004。

1.2 主要试剂及仪器 石英砂（SiO2），纯度≥99.5%，购于天津市江天化工技术有限公司；牛磺酸购于天津市光复精细化工研究所；TUNEL细胞凋亡检测试剂盒购于美国Promega公司；ELISA试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司。CO2培养箱、电泳仪、紫外分析仪、凝胶成像系统和低温离心机等购于艾本德中国有限公司。

1.3 动物分组和给药 将24只大鼠随机分为对照组、模型组和牛磺酸组，每组8只。各组大鼠麻醉后行支气管一次性灌注染尘。对照组大鼠支气管内灌注生理盐水（每只1.0mL）；模型组大鼠支气管内灌注 SiO2粉尘悬液（每只 1.0mL，50g·L－1）；牛磺酸组大鼠支气管内灌注SiO2（每只1.0mL，50g·L－1），且每天腹腔注射牛磺酸（每只1.0mL，200mg·kg－1）1次。各组大鼠在实验期间正常饮食，共饲养30d。

1.4 大鼠矽肺模型的建立 气管暴露法建立大鼠矽肺模型，各组大鼠腹腔注射0.4%戊巴比妥麻醉后，将其仰卧位固定于手术台上，手术器械和大鼠颈部皮肤用75%酒精消毒后，解剖并暴露气管。用1mL注射器在大鼠气管软骨间穿刺，快而平稳地于气管内注入粉尘悬液1mL，用手轻拍大鼠两侧胸壁，使粉尘分散至全肺，同时将大鼠直立使其尽快解除窒息，将皮下组织及肌肉复位，缝合皮肤并消毒。对照组大鼠以灭菌生理盐水1mL代替粉尘悬液。

1.5 各组大鼠肺泡灌洗液（bronchoal veolar lavage fluid，BALF）中AM 的收集 收集BALF，分离AM，将大鼠麻醉后暴露气管，从气管内插入直径为2mm的细塑料管，用4℃生理盐水进行肺脏灌洗，每次灌洗2mL，反复灌洗3次，收集 BALF。所取液体2 000r·min－1离心10min，弃上清，细胞沉淀置于RPMI 1640培养液中，在37℃、5%CO2培养箱中孵育3h，使AM贴壁。弃去非贴壁细胞，胰酶消化，收获AM。

1.6 ELISA法检测BALF中TNF-α水平 采用ELISA法测定BALF中TNF-α水平，严格按照试剂盒说明书进行实验操作。

1.7 TUNEL法检测各组大鼠AM凋亡情况 应用TUNELAM凋亡检测试剂盒检测AM凋亡情况。将收获的各组AM制成细胞悬液，在多聚赖氨酸包被的载玻片上涂片，使其成为单细胞层，自然风干后，采用4%多聚甲醛室温固定。按照试剂盒说明书完成各项操作，反应最后滴加DAB显色液，显微镜观察，当背景出现深棕色时浸入双蒸水中终止反应。结果判定：细胞核不规则，出现固缩，呈碎片状，有棕黄色颗粒的为凋亡细胞。高倍镜下计数200个细胞并计算凋亡指数（凋亡细胞占总细胞数的百分比）。

1.8 琼脂糖凝胶电泳检测凋亡AM的DNA断裂情况 提取各组大鼠AM的DNA，在质量分数为1.5%的琼脂糖凝胶中进行低电压电泳，于紫外分光仪下观察DNA条带。参照DNA标准相对分子质量在凝胶中的位置，判断细胞是否出现特征性DNA梯状带，并于凝胶成像系统照相。

1.9 统计学分析 采用SPSS 17.0统计软件对数据进行统计学分析。TNF-α水平和AM凋亡指数以±s表示，组间比较采用单因素方差分析。

2 结 果

2.1 各组大鼠BALF中TNF－α水平和AM凋亡指数 模型组大鼠BALF中TNF－α水平较对照组明显升高，差异有统计学意义（P＜0.01）。牛磺酸组大鼠BALF中TNF－α水平较对照组亦有所上升（P＜0.01），但与模型组比较有所降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。显微镜下可见凋亡AM细胞核固缩，不规则，被染成棕黄色。其中模型组和牛磺酸组大鼠BALF中出现AM凋亡的细胞数明显多于对照组，模型组和牛磺酸组大鼠BALF中AM凋亡指数与对照组比较差异均有统计学意义（P＜0.01）；但与模型组比较，牛磺酸组大鼠BALF中AM凋亡指数有所降低，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1和图1（插页五）。

表1 各组大鼠BALF中TNF-α表达水平和AM凋亡指数Tab.1 Levels of TNF-αexpression and apoptotic indexes of AM of rats in various groups （n＝8，±s）

表1 各组大鼠BALF中TNF-α表达水平和AM凋亡指数Tab.1 Levels of TNF-αexpression and apoptotic indexes of AM of rats in various groups （n＝8，±s）

＊ P＜0.01 vs control group；△P＜0.05 vs model group.

Group TNF-α[ρB/（ng·L－1）]Apoptotic index（η/%）Control 215.8±11.7 5.01±1.17 Model 528.2±23.3＊ 14.03±0.74＊Taurine 364.3±21.4＊△ 9.38±1.64＊△

2.2 琼脂糖凝胶电泳检测凋亡AM的DNA断裂结果 对照组未出现明显的DNA梯度条带，模型组出现凋亡细胞特征性的DNA梯度条带（DNA ladder），条带间距为200bp左右。牛磺酸组的DNA梯度条带较弱，明显低于模型组。见图2。

图2 各组大鼠BALF中AM的DNA断裂电泳图Fig.2 Electrophoregram of DNA fractures of AM in BALF of rats in various groups

3 讨 论

矽肺目前在我国是发病率较高的职业病之一，其主要表现为双肺的进行性纤维化，即使患者脱离矽尘作业环境，这种纤维化仍可继续发展[5]。AM是矽尘作用的主要靶细胞，作为第一道防线，AM在矽肺的发生发展中具有重要作用。矽尘进入胚泡后，AM吞噬矽尘颗粒，细胞活化并产生大量炎性因子和致纤维化因子。近年来国内外研究[6]表明：AM除了通过分泌大量细胞活性物质参与矽肺纤维化以外，其细胞凋亡在矽肺纤维化的发生发展过程中也发挥重大作用。细胞凋亡又称程序性细胞死亡（programmed cell death，PCD），是指细胞为了维持内环境稳定，由基因控制的自主的有序性的死亡。细胞凋亡涉及一系列基因的激活、表达及调控作用，是细胞高度有序的死亡过程。在矽肺病变早期，AM凋亡有利于清除受损细胞，消除炎症，重塑肺组织结构以利于维持正常的肺功能；但随着凋亡细胞数量的增加，则可能造成肺组织损伤，并加速炎症后肺纤维化的进程[7]。

AM吞噬粉尘颗粒后，释放多种生物活性物质，包括TNF-α、转化生长因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）、成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF）、血小板衍生生长因子（platelet-derived growth factor，PDGF）、胰岛素样生长因子（insulin-like growth factors，IGF）、白细胞介素1（interleukin-1，IL-1）和白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）等大量细胞因子。其中TNF-α是一种多效性的细胞因子，可以调节细胞凋亡、细胞增殖、免疫反应、病毒复制、过敏反应和自身免疫疾病等。TNF-α主要通过特异性细胞膜连接受体发挥作用。当肺组织损伤后，AM聚集到损伤组织周围并被激活，释放大量TNF-α。TNF-α活性的增加能够刺激成纤维细胞增生和胶原基质沉积而引发肺纤维化[2]。大量研究[8－10]表明：吸入矽尘后，大鼠肺泡AM及BALF中TNF－α分泌和mRNA的表达增加。本研究结果亦显示：模型组大鼠AM凋亡指数和BALF中TNF-α水平较对照组有明显增加，而牛磺酸组大鼠的各项指标均有一定程度的改善。

牛 磺 酸 即 2-氨 基 乙 磺 酸（NH2－CH2－CH2－SO3H），是一种含硫的β－氨基酸，因最初作为牛胆汁的组成成分，从动物组织中分离出来而得名。牛磺酸是一种机体内源性抗损伤和细胞保护物质，具有多种生物学效应[11]。牛磺酸在组织细胞内含量丰富，具有维持细胞内外渗透压平衡、稳定膜结构、调节细胞内钙稳态、清除氧自由基和抗脂质过氧化损伤等多种生物学功能。有研究[12－13]表明：牛磺酸可通过促进内源性NO的产生以及提高自由基清除酶的活性等途径起到对肺损伤的防治作用。牛磺酸通过下调TGF的表达抑制成纤维细胞的表型转化，继而对博来霉素引起的肺纤维化大鼠起到一定的干预作用[14]。牛磺酸能够抑制氧化应激反应，下调促凋亡基因的表达抑制细胞凋亡的发生[15－16]。细胞凋亡的发生是以细胞核的变化为主，其主要生化反应是细胞内的核酸内切酶活化，将核内染色体DNA有规律地降解，在琼脂糖凝胶电泳中呈现特征性的 “DNA ladder”（DNA梯状带）。本研究结果显示：模型组大鼠出现凋亡细胞典型的DNA梯状带，牛磺酸组大鼠的DNA梯度条带较弱，明显低于模型组。本研究结果提示：牛磺酸可以通过减少肺组织内TNF-α的表达，抑制AM凋亡，其中所涉及的一系列基因变化尚有待于进一步深入研究。

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