类固醇受体辅激活因子1基因多态性与2型糖尿病的关联性分析

石 鑫，官 鑫，唐 媛，吕 乐，乔乙春，刘雅文，李 勇，程 熠

（1.吉林大学第一医院心血管疾病诊治中心，吉林 长春 130021；2.吉林大学学报编辑部，吉林

长春 130021；3.吉林大学公共卫生学院流行病与卫生统计学教研室，吉林 长春 130021）

SHI Xin1，GUAN Xin2，TANG Yuan3，LYU Le3，QIAO Yi-chun3 LIU Ya-wen3，LI Yong3，CHENG Yi 1

（1.Center of Cardiovascular Disease Treatment，First Hospital，Jilin University，Changchun 130021，China；2.Editorial Board，Journal of Jilin University，Changchun 130021，China；3.Department of Epidemiology and Health Statistics，School of Public Health，Jilin University，Changchun 130021，China）

近年来，随着生活方式的改变，2型糖尿病（type 2diabetes mellitus，T2DM）的发病率逐年增高[1]。李慧等[2]研究结果显示：2010 年中国T2DM的发病人数约为0.432亿。预测2030年时糖尿病（diabetes mellitus，DM）患病人数将达5亿人。近年来，国内外对T2DM分子遗传学研究主要集中在与T2DM发病机制有关的蛋白质、酶和受体基因，包括胰岛素受体基因、脂联素和其他基因[3－7]。核受体（nuclear receptor，NR）在机体的生长发育、生殖和多种生理、代谢过程中发挥重要的作用[8]。类固醇受体是核受体家族的成员，包括糖皮质激素受体（glucocorticoid receptor，GR）、孕激素受体（progesterone receptor，PR）、雌激素受体（estrogen receptor，ER）等[9]。类固醇受体辅激活因子（steroid receptor co-activator，SRC）是辅激活因子中重要的一类，其能够与一些配体依赖式核受体相互作用，从而提高这些受体的转录活性[10]。目前国外直接用SRC-1基因位点多态性来确定SRC-1基因与糖尿病发病间的关系的研究报道很少，国内尚无相关报道。本研究选择SRC-1基因的3个标签单核苷酸多态性（Tag SNPs），采用病例对照研究的方法，讨论SRC-1基因多态性与T2DM的关系，为T2DM的病因学研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 一般资料 383名研究对象来自于2009年9月—2010年6月中石油吉化总医院T2DM患者和健康体检者。病例组研究对象为在中石油吉化总医院确诊首发T2DM的患者190例，其中男性110例，女性80例，年龄40～84岁，平均年龄（58.49±10.07）岁。对照组研究对象是在中石油吉化总医院体检的与病例组研究对象无血缘关系的健康人193例，其中男性114例，女性79例，年龄为40～86岁，平均年龄（57.54±10.72）岁。2组研究对象在年龄和性别上的分布差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2 纳入和排除标准 T2DM患者纳入标准：依据2007年美国糖尿病协会（ADA）关于T2DM的诊断标准，年龄大于40岁，中国北方汉族人。对照组研究对象选择标准：年龄大于40岁，无T2DM及相关疾患，空腹血糖值低于5.6mmol·L－1，中国北方汉族人。排除标准：年龄小于40岁者，患有T2DM及相关疾患者，空腹血糖值高于5.6mmol·L－1者，妊娠期 T2DM 糖尿病和其他特殊类型T2DM糖尿病患者，患有其他严重疾病可能会影响到T2DM病情的严重程度者，与病例组和对照组已纳入研究对象有血缘关系者。

1.3 主要试剂和仪器 溴化乙锭、溴酚蓝（大连宝生物公司，中国），琼脂糖、三羟甲基氨基甲烷（Promega公司，美国），乙二胺四乙酸（Sigma公司，美国），Taq DNA聚合酶（Qiagen公司，德国），血液基因组DNA提取试剂盒（TIANGEN公司，北京），引物由美国Invitrogen公司合成；精密移液器（Gilson公司，法国），AA-250型电子分析天平（BIO-RAD公司，美国），Du640型紫外分光光度计（BECKMAN 公司，美国），MALDI-TOF质谱仪（Sequenom公司，美国）。

1.4 样品采集和基因组DNA提取 采集所有研究对象的外周静脉血5mL，用于提取基因组DNA，按照DNA提取试剂盒说明书进行操作。

1.5 SRC-1基因 Tag SNPs的选择 利用 NCBI－SNP和HapMap数据库检索并下载SRC-1基因与ERα基因上的SNPs数据，结合Haploview 4.2软件，设置Haploview软件运行的参数分别为CHB，MAF＞10%，r2＞0.8，D’＝1，最终选择SRC-1基因上的rs3731628、rs4578807和rs11677500这3个Tag SNPs。rs3731628位于外显子24783355位置，等位基因为A/T；rs4578807位于内含子24775933位置，等位基因为A/G；rs11677500位于内含子24700319位置，等位基因为A/G。

1.6 DNA水平及纯度检测 测定在波长为260和280nm时所提取的DNA吸光度（A260和A280）值。利用DNA水平计算公式和DNA纯度计算公式分别计算DNA水平及纯度。DNA水平＝50g·L－1×A260×稀释倍数；DNA纯度＝A260/A280。

1.7 引物设计与合成 根据待测SNPs位点和相关序列，设计所需PCR扩增的前、后引物（1st-PCRP、2nd-PCRP）并合成。引物序列见表1。

表1 SRC-1基因3个SNPs位点引物序列Tab.1 Primer sequences of three SNPs sites of SRC-1gene

1.8 基因分型分析 提取纯化后的基因组DNA样品，按设计顺序每孔加入1μL样品，加入PCR扩增反应体系样品：5U·μL－1HotStar Taq酶0.2μL，ddH2O 1.8μL，10×PCR Bufferwith，15mmol·L－1MgCl20.5μL，25mmol·L－1MgCl20.4μL，25mmol·L－1dNTP Mix 0.1μL。PCR 反应条 件：94℃、15min，94℃、20s，56℃、30s，72℃、60s，共45个循环；72℃、3min。虾碱性磷酸酶（shrimp alkaline phosphatase，SAP）反应：利用SAP脱去PCR产物中剩余的磷酸基。将上述PCR产物中加入SAP预混 液（H2O 1.53μL，SAP Buffer 0.17μL，1.7U·μL－1SAP Enzyme 0.30μL）中，SAP反应条件：37℃、40min→85℃、5min→4℃、∞。单碱基延伸反应：将上述PCR＋SAP产物中加入2μL单碱基预混液体，单碱基延伸反应条件：94°C、30s；94°C、5s，5个巢式循环52°C、5s，80°C、5s，共45个循环；72°C、3min，4°C 结束。将单碱基延伸反应中的反应产物每孔加入16μL纯水和6mg树脂，以脱去延伸产物中的盐，摇匀15min，3 200r·min－1离心，设置加样参数，在芯片上点样。将目标序列的相关信息输入Typer 4.0软件中，将芯片置于质谱仪中，通过基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱分析（MALDI-TOFMS）技术检测延伸产物相对分子质量，确定每个SNP位点的基因分型。

1.9 统计学分析 采用 SPSS 16.0软件和

Haploview 4.2软件进行数据分析。应用拟合优度χ2检验分析病例组和对照组研究对象基因型频数分布是否符合Hardy-Weinberg（H-W）平衡。病例组与对照组研究对象不同等位基因与基因型的频数分布差异比较采用χ2检验，采用单倍型法分析多位点的联合作用与T2DM的关系。

2 结 果

2.1 SNPs质谱分析实验 当rs3731628位点基因型为AA时，在电荷量为6 309.0处出现最高峰；当基因型为TT时，在电荷量为6 248.0处出现单峰；当基因型为TA时，在电荷量为6 248.0和6 309.0处出现双峰。当rs4578807位点基因型为AA时，在电荷量为6 887.0处出现最高峰；当基因型为GG时，在电荷量为6 904.0处出现单峰；当基因型为AG时，在电荷量为6 887.0和6 904.0处出现双峰。当rs11677500位点基因型为AA时，在电荷量为6 778.0处出现单峰；当基因型为GG时，在电荷量为6 700.0处出现单峰；当基因型为GA时，在电荷量为6 700.0和6 778.0处出现双峰。见图1。

2.2 H-W 平 衡 检 验 结 果 SRC-1 基 因 上 的rs3731628和rs11677500位点在病例组与对照组中的基因型频数分布符合H-W平衡定律；rs4578807位点在病例组与对照组中的基因型频数分布不符合H-W平衡定律。

2.3 Tag SNPs之间连锁不平衡程度检验 SRC-1

基因上的3个Tag SNPs间的连锁不平衡程度分

析，r2＝0.8为判定连锁不平衡的界值，结果未发现rs3731628、rs4578807和rs11677500之间存在显著的连锁不平衡。

2.4 3个位点等位基因和基因型频数分布rs3731628、rs4578807和rs11677500位点在病例组和对照组中的等位基因的频数分布和基因型的频数分布差异无统计学意义（P＞0.05）；rs3731628位点的野生型（AA）和突变型（TA＋TT）频数在2组中的分布差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。rs4578807位点的野生型（AA）和突变型（AG＋GG）频数在2组中的分布差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。rs11677500位点的野生型（AA）和突变型（GA＋GG）频数在2组中的分布差异无统计学意义（P＞0.05）。见表4。

2.5 SRC-1基因3个位点联合分析 SRC-1基因上的 3 个位点组成的 rs11677500-rs4578807、rs4578807-rs3731628 和 rs11677500-rs4578807-rs3731628共3个单倍体型系统在病例组和对照组中的分布差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表5。

图1 SRC-1基因3个位点的基因分型Fig.1 Genotypes of three sites of SRC-1gene

表2 病例组与对照组SRC-1基因rs3731628位点等位基因和基因型频数分布Tab.2 Distribution of allelic and genotypic frequencies at rs3731628site of SRC-1gene in case group and control group

表3 病例组与对照组SRC-1基因rs4578807位点等位基因和基因型频数分布Tab.3 Distribution of allelic and genotypic frequencies at rs4578807site of SRC-1gene in case group and control group

表4 病例组与对照组SRC-1基因rs11677500位点等位基因和基因型频数分布Tab.4 Distribution of allelic and genotypic frequencies at rs11677500site of SRC-1gene in case group and control group

表5 SRC-1基因多位点联合分析Tab.5 Combined analysis of multilocus of SRC-1gene

3 讨 论

目前研究者[12－13]已经发现了一些基因与T2DM的发病有关联，包括胰岛素受体基因、脂联素和线粒体基因等。本研究应用候选基因法，选取了SRC-1基因，并通过筛选，选择SRC-1基因上的rs3731628、rs4578807和rs11677500 3个 Tag SNPs，分析了SRC-1基因多态性与T2DM之间的关系，其中，SRC-1基因上的rs4578807位点不符合H-W平衡，因此在本次研究中，与rs4578807位点相关的分析结果不具有人群代表性。

本研究结果显示：SRC-1基因上的rs3731628、rs4578807和rs11677500 3个Tag SNPs与T2DM无关联。一个基因上有许多SNPs，并且SNPs间有关联，可以用一个SNP或多个SNP的组合代表另外的SNP或单倍体型（单倍体型是指位于一条染色体上或某一区域的一组相关联的SNP位点），本研究对SRC-1基因上3个Tag SNPs位点所组成的3个单倍体型与T2DM的关联性分析结果显示：3个单倍体型均与T2DM的发生无关联。上述结果提示SRC-1基因可能不是T2DM的易感基因，出现该结果可能的原因：①本次研究由于样本量不足，未显示出SRC-1基因多态性与T2DM真实存在的关联，因此不足以验证SRC-1基因与T2DM的关联性。②SRC-1基因可能不是T2DM的易感基因，也有可能只是T2DM的众多易感基因中的一个微效基因，由于T2DM的发生是许多微效基因形成叠加效应引起的。单独的SRC-1基因对T2DM的发生影响很小，因此难以达到统计学上的显著性水平。③研究对象的种族选择单一，由于T2DM易感基因存在着种族和地域之间的差异，不同种族和地域的易感基因不同，本研究只选择中国北方汉族人群为研究对象，不能排除在其他人群中SRC-1基因与T2DM的关联。

已有研究[14]表明：ERα与T2DM的发生发展有一定的关系，对机体脂代谢和糖代谢有影响。SRC-1是ERα辅激活因子，SRC-1表达水平的改变，会直接影响ERα在细胞中的表达活性，并最终引起靶基因转录活性的改变。T2DM是一种以高血糖为主要特点的多因素遗传病。长期高血糖可影响着机体的组织、系统，使其发生病变，引起一系列的并发症，这些并发症是糖尿病患者致死、致残的主要原因。本研究结果显示：SRC-1基因上rs3731628、rs4578807和rs11677500位点与T2DM并发症无关联，提示SRC-1基因多态性对中国汉族T2DM人群T2DM并发症无影响。

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