自体软骨细胞移植技术修复关节软骨损伤研究进展

姜骆永陈洁琳崔家鸣林威熊建义王大平朱伟民

1深圳大学第一附属医院运动医学科（广东 深圳 518000）2深圳市运动医学技术工程实验室（广东 深圳 518000）3深圳市组织工程重点实验室（广东 深圳 518000）

自体软骨细胞移植技术修复关节软骨损伤研究进展

姜骆永1，2，3陈洁琳2，3崔家鸣1，2，3林威1，2，3熊建义1，2，3王大平1，2，3朱伟民1，2，3

1深圳大学第一附属医院运动医学科（广东 深圳 518000）2深圳市运动医学技术工程实验室（广东 深圳 518000）3深圳市组织工程重点实验室（广东 深圳 518000）

关节软骨损伤后其再生能力极为有限。随着细胞治疗与软骨组织工程等相关技术和学科的发展进步，自体软骨细胞移植术（autologous chondrocyte implantation，ACI）已发展到第三代。与传统的治疗方法相比，ACI技术在治疗软骨损伤方面有着明显的优势，已被越来越多的患者接受，其临床效果已得到肯定，但仍需进一步改进。本文对近年来国内外的相关研究进展进行总结，从软骨损伤的传统治疗方法及其发展、自体软骨细胞移植术、基因修饰在ACI中的应用等三个方面对自体软骨细胞移植技术修复软骨损伤进行综述，并分析其优缺点和发展史，着重介绍自体软骨细胞移植技术和基因修饰在其中的应用。

软骨损伤；自体软骨细胞移植；基因修饰

关节软骨损伤是一种常见病，多见于膝关节、髋关节等负重关节，常引起关节疼痛、肿胀及僵硬等症状，可对患者尤其是青少年造成不可逆的损害，严重影响生活质量[1]。关节软骨组织主要由大量细胞外基质和包裹其中的软骨细胞组成，是一种缺乏血管、淋巴、神经的特殊结缔组织，其营养来源主要依赖于关节腔内滑液和软骨下骨的血供，再生能力有限，直径大于4 cm的损伤一般不能自行修复[2]。至今已有多种治疗方法应用于膝关节软骨损伤的修复，包括最初采用的穿破软骨损伤区域软骨下骨，使骨髓间充质干细胞分化修复软骨损伤的骨髓刺激技术，到后来利用在骨膜和软骨膜中存在间充质干细胞来修复软骨损伤的骨膜移植以及自体/异体软骨组织移植技术。近年来，随着细胞治疗及组织工程技术的发展，目前对软骨损伤的治疗方法是基于细胞和组织工程方法来修复软骨损伤的技术。

1 传统治疗方法及其发展

传统治疗软骨损伤的方法主要包括关节灌洗、骨髓刺激术（钻孔和微骨折术）及自体软骨移植术等。研究报告称骨髓刺激术在小范围损伤的年轻患者中治疗效果显著，对于年龄偏大的患者效果欠佳[3]。微骨折术修复的主要是纤维软骨，其硬度、生物力学、耐摩擦能力等均无法与正常的透明软骨相比[4]，后期退变风险较大。Stanish等[5]将混有自体全血的壳聚糖填塞到运用微骨折术处理过的软骨损伤处，经证实有利于增加血凝块的稳定性及促进骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化。Sharma等[6]成功利用可注射性水凝胶结合微骨折术对软骨损伤进行修复，由于该水凝胶具有可注射性和可塑性，因此该方法在修复不规则软骨损伤时具有明显的优势。自体骨软骨移植术（Osteochondralautograft transfer，OAT）通过移植非负重区的骨软骨栓至软骨损伤处进行修复。该方法受供区软骨来源限制，通常仅用于损伤面积较小的患者。Marcacci等[7]对30例软骨损伤面积小于2.5 cm2的膝关节全层软骨损伤的患者行自体骨软骨移植治疗，术后随访7年，结果显示：对于较小的软骨损伤，自体骨软骨移植术表现出较好的中、长期疗效。Lane等[8]研究也表明自体骨软骨移植对于面积小于2 cm2的软骨损伤的修复效果最佳，对于面积在2～4 cm2的软骨损伤也有很好的临床疗效。面积小于4 cm2的软骨损伤患者选择OAT技术可达到较好的临床疗效，而对于损伤面积大于4 cm2的患者则建议选择细胞移植疗法。尽管异体软骨移植术可以解决OAT供体来源不足等问题，但是由于存在移植物排斥和疾病传染等风险，该技术在应用上受到一定的制约[9]。

2 自体软骨细胞移植术

自体软骨细胞移植技术（autologous chondrocyte implantation，ACI）是基于自体软骨细胞体外扩增后进行回植修复的技术。研究表明，体外培养扩增的软骨细胞能较好地维持其细胞特性，利于软骨修复[10]。一项进行了至少10年的随访研究证实，ACI能使70%的患者获得满意的长期疗效[11]。ACI治疗软骨缺损的适应症包括：①软骨损伤面积大于2 cm2；②外伤或剥脱性骨软骨炎引起的软骨缺损；③患者年龄一般在15～55岁；④患者愿意接受并配合执行严格的康复计划；⑤无系统性感染[12]。对于有以下情况之一者不建议使用ACI治疗：①类风湿性或炎性关节炎相关的软骨缺损；②体重指数（BMI）高于正常值1.5倍的肥胖患者；③除外下列感染性疾病，如HIV、乙型、丙型肝炎、梅毒等；④伴有全身或局部感染。对于下列病理状况则需在术前或术后予以矫正：①交叉韧带不稳定或承重线不良的关节；②髌骨切迹异常；③半月板病变或功能性半月板缺失。以下将分述三代ACI技术的发展。

2.1第一代自体软骨细胞移植术

1987年，瑞典医生Brittberg在世界范围内首次进行了利用体外培养的自体软骨细胞治疗软骨损伤的研究，并于1994年将该技术发表在《新英格兰医学》上[13]。第一代ACI（P-ACI）技术将体外混悬培养的自体软骨细胞移植到软骨损伤处，并结合自体骨膜进行覆盖，该方法可修复深度在6～8 mm以上的软骨损伤[14]。由于其采用自体骨膜覆盖，容易出现骨膜增生现象，往往需要通过关节镜进行再次切除[15]，造成软骨下骨密度增加，增加了新生软骨组织承受的应力，从而导致新生软骨组织发生退化[16]。Henderson[17]等对170例术后患者进行调查，结果发现2年内需再次手术解决骨膜增生问题的患者高达74%，跟踪随访表明该部分患者关节功能恢复明显差于未进行再次手术者。

2.2第二代自体软骨细胞移植术

第二代ACI（C-ACI）使用胶原膜替代自体骨膜覆盖于软骨损伤处，减少了摘取骨膜引起的并发症和简化了手术的操作流程。研究显示C-ACI临床疗效与PACI相当，而新生软骨增生肥大现象则相对减少。Steinwachs等[18]对63例膝关节软骨损伤患者应用I/III型胶原膜进行覆盖，术后随访3年，关节镜探查未发现新生软骨增生肥大迹象。Samuelson等[19]研究显示，CACI手术使用胶原膜的费用比用自体骨膜高，但长远来看，由于骨膜增生需要进行二次手术及处理相关并发症，因此C-ACI更为经济。尽管初期的报告显示二代ACI骨膜增生的并发症较一代ACI更少[20]，但是依然存在细胞漏渗、分布不均和胶原膜脱落等不足。

2.3第三代自体软骨细胞移植术

为改善前两代ACI的缺陷，第三代ACI即基质诱导的自体软骨细胞移植术（matix-autologous chondrocyteimplantation，MACI）应运而生。经典的MACI技术通过体外扩增培养软骨细胞，并将其种植于Ⅰ/Ⅲ型胶原膜粗糙面上然后进行回植，最后使用可吸收线缝合固定以进行修复。由于软骨细胞粘附于三维胶原膜内，该技术减少了细胞逸出和分布不均的风险和提高了术后软骨细胞的存活率。研究表明，软骨细胞在三维环境下生长有利于软骨细胞表型和正常功能的维持，提高新生组织透明软骨的生成率[21，22]。Ebert等[23]报道的20例采用关节镜MACI治疗的患者中，在术后2年随访的MRI检查中，约90%的软骨损伤被治愈，70%与周边的软骨合为一体。Basad等[24]对65名软骨缺损在3～10 cm2患者MACI治疗术后长达5年的随访研究表明，94%患者功能在术后2年得到极大提升，术后5年亦有不错的疗效。由此可见，MACI技术的短期及中长期疗效是值得肯定的。

MACI与其他治疗方法的比较研究迄今也有不少报道。Basad等[25]对20例患者采用了微骨折治疗，对40例软骨损伤大于4 cm2的患者采用了MACI治疗，术后两年将两组患者进行对比发现，采用MACI治疗的患者术后结果优于微骨折组。而与OAT相比较，Clavé等研究证明，MACI对于面积大于3.5 cm2缺损的临床疗效并没有OAT理想，而对小于3.5 cm2的缺损两者没有明显差异[26]。Zeifang及Aldrian等[27，28]的临床研究随访显示，MACI相较ACI在短期和中长期的治疗效果上均令人更为满意。然而，最近有研究对180名MACI术后患者2年的MRI随访表明，约26.1%的患者术后2年仍存在回植物异常增生的现象，并且年龄小、BMI偏低者，异常增生发生率更高。因此，MACI的确切疗效及适应症还需要更多的数据来证实[29]。

最新的MACI已发展到使用生物相容性更好的纤维蛋白胶进行粘合，不再需要进行缝合，使手术操作更加简易，大大缩短了手术时间，同时也降低了细胞渗漏的风险[30]，这将成为今后手术发展的一个方向。现将三代ACI技术的优缺点归纳总结于表1。

2.4支架材料在自体软骨细胞移植术中的研究与应用

支架材料一直是MACI研究中的热点问题。采用支架材料的三维培养法使软骨细胞处于更接近于人体内的立体细胞外基质微环境中，可减少软骨细胞经多次传代后的去分化现象。理想的支架材料应具有良好的生物相容性、可控的生物降解速率、良好的力学性能及可塑性，高度多孔的三维立体结构有利于细胞黏附与生长，从而为种子细胞提供良好的生长环境，促进细胞分化与代谢[31]。I/III型胶原膜因其良好的生物相容性和可降解性、与细胞亲和力高、抗原性低及拉伸强度高等优良性质而在自体软骨细胞移植术中得到广泛的应用[32]。但胶原膜也存在机械性能差、降解速率过快、强度不足、花费较高等缺点。透明质酸钠也常用于软骨组织工程，在临床细胞移植治疗软骨缺损中也有较广泛的应用，它能给种子细胞生长提供类似胚胎软骨发育的微环境，并能长期促进细胞增殖分化[33，34]。近年来，水凝胶材料因其和软骨相似的双极性以及促进软骨细胞生长分化而成为研究的热点。Popa等[35]将脂肪干细胞包裹在水凝胶内进行培养，结果显示干细胞向软骨方向分化。Kim等[36]使用低聚糖复合水凝胶作为支架材料复合软骨细胞修复兔软骨损伤，结果显示修复组织呈透明软骨样。目前软骨细胞培养支架研究取得了巨大的进步，为了将支架材料不确定的危险因素降到最低，Shimomura等[37]提出不使用支架材料而使用间充质干细胞（如自体滑膜）代替的方法将是下一代软骨细胞移植技术发展的方向。但是，该技术应用于临床前还需进行长期而深入的研究。

表1　三代ACI技术比较

3 基因修饰在ACI中的应用

随着分子生物学和基因技术的快速发展，基因导入等方法在组织工程中的研究应用也日益广泛。自体软骨细胞移植中的基因修饰是将目的基因通过载体导入软骨细胞，经修饰的软骨细胞可在软骨再生过程中持续、高效地在局部分泌生长因子，从而促进软骨修复。Che等[38]将导入骨形态发生蛋白-7（BMP-7）基因的软骨细胞种植到胶原膜上，再将该胶原膜植入兔膝关节损伤处进行修复，12周后实验组可形成透明软骨，糖胺聚糖及DNA含量明显高于对照组，提示转染BMP-7的软骨细胞能够促进软骨损伤的修复。此外，转化生长因子β1（TGF-β1）转染的软骨细胞治疗关节炎患者已进入了一期临床试验，进行安全性评估，初步结果显示该方法无明显的安全性问题[39]。虽然基因修饰在软骨细胞移植中有着极好的应用前景，但是在该方法应用于临床前还有许多问题亟待解决，比如如何选择合适的基因、调节基因序列、基因转染载体以及基因长期稳定的表达调控等。

生长因子对软骨细胞的增殖、分化及代谢具有重要作用，因此常成为研究者们转染软骨细胞的首选。其中，转化生长因子β1（TGF-β1）、人骨形态发生蛋白-4（BMP-4）及血小板衍生生长因子（PDGF）的研究应用最为广泛。Jin等[40]成功利用TGF-β1诱导骨髓间充质干细胞分化为软骨细胞，但TGF-β1半衰期短，进入体内后易快速扩散、变性或者发生酶解，故需反复大剂量应用。Miljkovic等[41]研究证实，在软骨细胞移植时，无论是体内培养还是体外培养，BMP-4都能很好抑制软骨细胞过度增生，并能维持稳定的软骨再生，但体外培养时BMP-4也存在相对半衰期较短的问题。因此，若能采用合理的方式传递BMP-4到达软骨损伤处如转染至软骨细胞将是一种非常有前景的治疗软骨损伤之法。

4 展望

由于自体细胞移植技术能够较好地修复损伤的关节软骨，具有手术操作简单、手术时间短、出血少、术后康复快、效果好等明显优势，已成为目前较为理想和有效的软骨损伤治疗方法。但是如何解决软骨细胞体外培养过程中的快速增殖并抑制其去分化、术后修复软骨与周围正常软骨的融合及其力学性能等问题，还有待进一步研究。对支架材料、生长因子及基因修饰方法的研究及应用，有望通过自体细胞移植技术实现软骨损伤的完全修复。

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2015.12.13

国家自然科学基金面上项目（编号：81572198），广东省自然科学基金（编号：2015A030313772），广东省科技计划项目（编号：2013B021800100，2015A020212001），深圳市科技计划项目（编号：JSGG20140519105550503，JCYJ20140414170821200，JCYJ20140414170821164，CXZZ20140813160132596）

朱伟民，Email：szhzwm@126.com