有氧运动对12月龄大鼠腓肠肌PGC-1α/Sirt3的影响

张盼盼 郑宁 张翠 刘玉倩 王海涛

河北师范大学体育学院人体运动生物信息测评重点实验室（石家庄 050024）

有氧运动对12月龄大鼠腓肠肌PGC-1α/Sirt3的影响

张盼盼 郑宁 张翠 刘玉倩 王海涛

河北师范大学体育学院人体运动生物信息测评重点实验室（石家庄 050024）

目的：探讨运动预防增龄性骨骼肌衰减中去乙酰化酶3（Sirtuin3，Sirt3）的调控机制，为运动预防肌肉衰减提供理论依据。方法：20只12月龄雄性SD大鼠随机分为对照组（CG）和运动组（EG，15 m/ min，第1周30 min/d，每周递增5min，跑台坡度为5%，6 d/w，4 w），每组10只。腓肠肌切片HE染色计算横截面积百分比；测定大鼠腓肠肌Mn-SOD、MDA含量；ELISA法测定8-羟基脱氧鸟苷（8-hydroxy-2deoy⁃guanosine，8-OHdG）含量；Western Blot法检测大鼠腓肠肌细胞内Sirt3和PGC-1α蛋白含量变化。结果：（1）HE染色的组织切片中运动组大鼠腓肠肌所占面积百分比显著高于对照组（P＜0.05）。（2）运动组大鼠腓肠肌Mn-SOD活性高于对照组（P＜0.01）；MDA、8-OHdG含量低于对照组（P＜0.05，P＜0.01）；（3）运动组大鼠腓肠肌PGC1-α和Sirt3蛋白表达量高于对照组（P＜0.01）。结论：适度有氧运动通过促进12月龄大鼠腓肠肌PGC1-α和Sirt3蛋白表达，提高抗氧化酶活性，减轻骨骼肌过氧化损伤，预防增龄性骨骼肌衰减。

有氧运动；增龄性骨骼肌衰减；去乙酰化酶3

衰老会导致骨骼肌结构与功能的退化，这与骨骼肌细胞中活性氧（reactive oxygen species，ROS）的增龄性聚积密切相关。近年研究表明定位于细胞线粒体中的去乙酰化酶3（Sirtuin3，Sirt3）与细胞能量代谢、氧化应激密切相关。Sirt3是过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅助活化因子1α（peroxisome proliferators activated receptor-gamma coactivator 1 α，PGC-1α）的下游靶基因，可对细胞ROS的生成与线粒体生物合成产生影响。已有研究证实运动能提高骨骼肌的机能，增加骨骼肌的质量与力量[1]。过表达的Sirt3和PGC-1α可以抑制体外培养的肌细胞中的ROS水平[2]。虽然确切的分子机制还尚未明确，但是增龄相关的Sirt3和PGC-1α的含量的下降会增加细胞的氧化损伤，引起基因突变、线粒体功能的退化和肌肉萎缩等[3]。Sirt3是否参与了运动预防增龄性骨骼肌衰减的过程，尚需深入研究。本研究旨在通过对12月龄的大鼠进行有氧运动，测定其腓肠肌Sirt3和PGC-1α蛋白含量、DNA损伤和抗氧化能力的变化，探讨PGC-1α/Sirt3通路在运动预防骨骼肌增龄性衰减的作用，为运动预防衰老提供理论依据。

1 研究方法

1.1 动物分组和运动方案

20只12月龄清洁级健康雄性SD大鼠（山东鲁抗医药公司），体重500±40 g，许可证号：SCXK鲁20080002。实验大鼠单笼饲养，不限制饮食，每天12 h自然光照，动物房内温度平均23℃～28℃，相对湿度为50% ±5%。适应性饲养1周后随机将其分为对照组（control group，CG）和运动组（exercise group，EG），每组10只。运动组大鼠进行为期4周的跑台运动，每周训练6天，跑台速度为15 m/min，正式实验第1周每天训练30 min，此后每周递增5 min，跑台坡度为5%（运动强度约为50%～60%VO2max[4-6]）。为了研究运动预防骨骼肌增龄性衰老中Sirt3的作用，本研究选用的是处于老龄前的12月龄大鼠。

1.2 指标检测

1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉（0.5 ml/100 g），取腓肠肌外侧头浸泡于4%多聚甲醛中固定；取另一腓肠肌外侧头投入液氮，以备其它指标测定。常规石蜡包埋，制作腓肠肌切片（6 μm），常规苏木精-伊红染色（HE染色），采用北航图像分析系统对所有图片进行肌细胞横截面积百分比计算。每张切片取左上、右上、左下、右下以及中心点五点统计。统计每张切片中肌细胞所占面积与整个视野面积的百分比[7-8]。

提取骨骼肌线粒体，检测Mn-SOD、MDA及8-羟基脱氧鸟苷（8-hydroxy-2deoyguanosine，8-OHdG）含量测定的试剂盒由南京建成生物科技公司提供，检测方法均按照说明书的步骤进行操作。

采用Western Blot法进行Sirt3和PGC-1α蛋白含量的测定，首先Bradford法测定腓肠肌总蛋白浓度，再进行SDS-PAGE电泳，其中加入1∶3000的Sirt3抗体（Santa Cruz）、1∶3000的PGC-1α抗体（Santa Cruz）、β-actin抗体（Santa Cruz）的兔抗大鼠蛋白的一抗，4℃过夜，洗膜后加入1∶5000的辣根过氧化物酶标记的二抗（山羊抗兔IgG）。化学发光法统计目的蛋白与βactin的MaxOD比值。实验在河北师范大学人体信息测评重点实验室完成。

1.3 结果统计与分析

使用SPSS18.0对数据进行分析，所得数据用平均数±标准差表示（±s），组间采用独立样本T检验，P＜0.05表示差异具有显著性，P＜0.01表示差异具有高度显著性。

2 结果

2.1 各组大鼠体重和肌细胞横截面积比较

与对照组相比，运动组大鼠体重上升趋势平缓，且经过4周运动大鼠体重也无明显上升，运动组大鼠体重小于对照组大鼠（P＜0.05）。对照组大鼠腓肠肌细胞呈现松散、不规则排列等特点，细胞核内移；而运动组大鼠腓肠肌细胞排列较为整齐、规则，细胞核皆位于细胞边缘。见表1、图1。

表1 各组大鼠体重和肌细胞横截面积比较（n=10）

图1 大鼠骨骼肌HE染色（×100）

2.2 各组大鼠腓肠肌过氧化水平比较

运动组大鼠腓肠肌细胞Mn-SOD活性高于对照组（P＜0.01）；运动组大鼠腓肠肌细胞MDA含量低于对照组（P＜0.05）；运动组大鼠腓肠肌细胞8-OHdG含量低于对照组（P＜0.01）。见表2。

表2 大鼠腓肠肌Mn-SOD活性、MDA含量及8-OHdG含量（n=10）

2.3 Sirt3与PGC-1α蛋白结果

运动组大鼠腓肠肌细胞Sirt3蛋白含量（0.94± 0.09）明显高于对照组（0.68±0.07）（P＜0.01）；运动组大鼠腓肠肌细胞PGC1-α蛋白含量（1.75±0.26）明显高于对照组（1.36±0.24）（P＜0.01），统计结果呈现非常显著性差异。见图2。

图2 Western Blot法测得大鼠腓肠肌细胞Sirt3 及PGC1-α蛋白（n=10）

3 讨论

3.1 有氧运动对12月龄大鼠骨骼肌组织学的影响

骨骼肌细胞的横截面积是骨骼肌是否发生结构和功能退化的重要指标。衰老进程中骨骼肌质量会逐渐下降，伴随着骨骼肌质量的明显下降，脂肪组织会渐渐增加[9]。经过CT扫描，发现老年人四肢中的非肌肉组织（脂肪和其他组织）远远高于年轻人，老年人骨骼肌横断面积仅为年轻人的70%左右。超声影像学表明老年人相比较年轻人，股四头肌横断面积减小了25%～35%，非肌肉组织增加了59%[10]。本研究结果显示，4周跑台运动后12月龄大鼠的腓肠肌细胞横截面积百分比高于对照组，说明有氧运动增加了大鼠骨骼肌的含量，运动可有效预防骨骼肌的增龄性衰减。HE染色观察组织切片表明，4周运动有氧运动组大鼠腓肠肌细胞核多位于细胞边缘，且肌纤维排列紧密、整齐。而随着年龄的增长，对照组大鼠出现肌纤维萎缩，组织学主要表现为出现小角化纤维、细胞横切面圆形化、细胞核内移等，这与相关衰老骨骼肌的组织学特征一致[11]。

3.2 有氧运动对腓肠肌细胞氧化应激指标的影响

Mn-SOD存在于生物体细胞的线粒体中，能更好地清除超氧自由基，抵御氧化损伤。本研究结果显示，有氧运动组大鼠腓肠肌细胞Mn-SOD活性高于对照组，说明中等强度的跑台运动有效地提高了运动组大鼠腓肠肌的抗氧化能力，使细胞减少ROS损害。这与以往长时间的耐力运动提高组织Mn-SOD活性的研究一致[12-14]。

MDA的含量高低与细胞受ROS攻击及损伤的程度成正比[15]。运动对骨骼肌细胞MDA含量的影响通常会与运动类型相关。力竭运动会引起大鼠骨骼肌细胞过氧化增强，MDA含量明显增加[16]。长期适量的运动才可以有效降低骨骼肌细胞MDA的含量[17-18]。本研究显示，4周有氧运动组大鼠腓肠肌细胞MDA含量低于对照组，这主要是由于有氧运动后增加的Mn-SOD活性有效地降低了老龄大鼠的MDA，说明有氧运动能有效地保护老龄大鼠骨骼肌细胞，使其所受的氧化应激损伤得到缓解。

8-OHdG可以用来评价生物体细胞内DNA氧化损伤的程度[19]，近年被应用到关于衰老及退行性疾病的研究中。有学者提出线粒体DNA（mtDNA）更容易遭受氧化损伤，其诱发因素是8-OHdG的聚积进而引发的碱基的损害[20]。本研究显示，4周的跑台运动干预后，运动组大鼠腓肠肌细胞线粒体8-OHdG含量低于对照组，这说明运动可以减少mtDNA的氧化损伤，保持肌细胞线粒体功能和结构的完整，缓解骨骼肌的衰减，这与组织学的研究结果一致。

3.3 有氧运动对大鼠腓肠肌细胞Sirt 3和PGC-1α蛋白含量的影响

本研究结果显示，经过4周的跑台运动后，大鼠腓肠肌细胞Sirt3和PGC-1α蛋白含量均有所上升。PGC-1α作为细胞能量代谢的重要的调节因子，在骨骼肌细胞呼吸及其细胞与线粒体的能量生成中发挥重要的作用[21]。研究结果表明运动能够诱导骨骼肌细胞PGC-1α表达量上升。过表达的PGC-1α可以促进Sirt3的表达，PGC-1α基因敲除的小鼠其Sirt3的表达也有所降低[2]。这与实验中4周有氧运动后大鼠腓肠肌细胞Sirt3上升是一致的。

Sirt3可以通过控制线粒体中活性氧ROS的产生调节细胞的氧化还原平衡[22]。Sirt3基因敲除小鼠骨骼肌肌细胞ROS生成量有显著增加[23]，并且线粒体Sirt3能够通过增强Mn-SOD的活性来提升机体的线粒体ROS的清除能力[24]。同时，转录因子Foxo3a经Sirt3去乙酰化作用后，进入细胞核，可以提高抗过氧化氢酶（CAT）及Mn-SOD的mRNA的表达水平，并抑制细胞内ROS的蓄积[25-26]。本研究结果表明，4周跑台运动促进了大鼠腓肠肌线粒体内Mn-SOD的表达，Mn-SOD通过歧化反应抑制自由基的链式反应，进而维持体内的自由基平衡，避免在衰老进程中细胞氧化应激水平失衡，造成肌细胞损伤。运动组大鼠腓肠肌细胞线粒体8-OHdG含量、MDA降低也证实其受到的过氧化损伤较轻。

4 结论

有氧运动通过促进12月龄大鼠骨骼肌PGC-1α/ Sirt3通路，增强骨骼肌Mn-SOD的表达，提高抗过氧化能力，保护骨骼肌细胞免受氧化损伤，进而预防骨骼肌增龄性衰减。但关于运动激活的Sirt3通路是否能逆转衰老大鼠（20月龄）的骨骼肌衰减及运动对青年鼠和衰老鼠在Sirt3激活中是否存在差异还需深入探讨。

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Effects of Aerobic Exercises on PGC-1α/Sirt3 in Gastrocnemius of 12-month-old Rats

Zhang Panpan，Zheng Ning，Zhang Cui，Liu Yuqian，Wang Haitao
College of Physical Education，Hebei Normal University，Shijiazhuang 050024，China

Wang Haitao，Email：haitaoyq@126.com

ObjectiveTo investigate the effect of aerobic exercises on the expression of PGC-1α and Sirt3 in gastrocnemius of aging rats，and explore the molecular mechanism of alleviating age-relat⁃ed muscle atrophy through exercises.MethodsTwenty male Sprague-Dawley rats were randomly divid⁃ed into a control group（CG）and an exercises group（EG），each of 10.The rats in EG underwent 4 weeks of 5%-gradient treadmill exercises at 15m/min，six days a week.They were trained 30min for the first week，with an increase of 5min for each week.The slices of their gastrocnemius were given he⁃matoxylin-eosin dying to evaluate the crosscut area percentage.The contents of Mn-SOD and MDA of gastrocnemius were observed using ultraviolet spectrophotometry，and the content of 8-OHdG was mea⁃sured using ELISA kits.The protein levels of Sirt3 and PGC1-α were examined using Western blot⁃ting.Results（1）The percentage of gastrocnemius cross-sectional area of EG was significantly higher than that of the CG（P＜0.05）.（2）The activity of Mn-SOD was significantly higher in EG than CG（P＜0.01），but the average contents of MDA（P＜0.05）and 8-OHdG（P＜0.01）of EG were significantly lower than the latter.（3）The expression of Sirt3 and PGC1-α in gastrocnemius increased significantly after 4-week running（P＜0.01）.ConclusionProper aerobic exercises can promote the expression of PGC1-α and Sirt3，increased antioxidase activities and relieve peroxidation damage in 12-month-old rats，which serves to prevent age-related muscle atrophy.

aerobic exercises，age-related muscle atrophy，Sirt3

2016.03.08

河北省自然基金（C2013205026）；河北师范大学重点基金（L2013Z08）；河北省体育教育训练学重点学科资助

王海涛，Email：haitaoyq@126.com