用液相色谱-串联质谱联用技术检测4种刺激剂类禁用物质

丁晶琳 董颖 张丽娟 赵君 马艳华 闫宽

1国家体育总局反兴奋剂中心（北京 100029）

2北京化工大学理学院（北京 100029）

用液相色谱-串联质谱联用技术检测4种刺激剂类禁用物质

丁晶琳2董颖1张丽娟2赵君2马艳华1闫宽1

1国家体育总局反兴奋剂中心（北京 100029）

2北京化工大学理学院（北京 100029）

目的：使用液相色谱-串联质谱联用技术，为世界反兴奋剂机构（WADA）在检测窗口中拟增加的4种刺激剂甲磺美嗪（amezinium methylsulfate，I）、吗拉宗（morazone，II）、贝美格（3-ethyl-3-methylglu⁃tarimide，III）和阿拉明（metaraminol，IV）建立了常规检测方法，并对方法进行考察和验证。方法：用5%的醋酸铅水溶液将样品中蛋白质等大分子沉淀后，离心10分钟，取上清液上机检测。质谱采用电喷雾电离源（ESI），在正离子模式下，通过多反应监测（MRM）模式对样品进行分析。结果：经过定性和定量分析，得到上述四种刺激剂的检测限（LOD）分别为0.1、0.5、5和0.5 ng/mL；定量限（LOQ）分别为0.3，1.5，15和1.5 ng/ mL；线性范围（r2＞0.99）分别在0.3～5000、1.5～3000、15～3000和1.5～4500 ng/mL之间。每种刺激剂在低、中和高3个浓度范围的基质效应均在98%～120%之间；准确度误差在9%以内；日内精密度的标准偏差低于7.7%，日间精密度的标准偏差不超过10%。结论：本研究建立的检测方法具有样品前处理简单、灵敏度高、准确度好和基质干扰较小等特点，满足兴奋剂检测实验室的要求，并已经应用于常规检测中。

液相色谱--串联质谱联用；刺激剂；方法验证；兴奋剂控制

刺激剂包含能够增加刺激性、暂时缓解疲劳以及可能增强竞技性、攻击性等生理作用的各类物质，如以苯丙胺为代表的中枢神经刺激剂，以麻黄碱为代表的末梢交感神经刺激剂等。刺激剂是竞技体育中滥用历史最长的兴奋剂。刺激剂作用于中枢或外周神经系统，可使运动员的行为和能力得到较快调整。刺激剂还可以提高肌肉的工作效率，减缓或加速消除疲劳，使运动员能够进行长时间和大强度的训练。但使用刺激剂类药物的副作用也是显而易见的，此类药物会降低使用者的身体感知能力，削弱部分人体的自我保护功能。服用后，人体亢奋状态持续一段时间后会进入极度疲劳状态。服用大剂量的刺激剂更会影响心肺功能，使人体器官超负荷运转，造成器官损伤，严重者会引起血压急剧上升和心律不齐等，更有甚者会导致死亡。

气相色谱-氮磷检测（GC-NPD）技术是刺激剂传统的检测方法[1-4]，但该方法具有检测重现性较差和灵敏度低等缺点。也可将刺激剂衍生化后用气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）进行检测[5]，但该方法的前处理繁琐，所用衍生化试剂毒性大，干扰因素多且方法稳定性差。为简化样品前处理步骤，实现高通量、快速的检测目标，文献报道[6，7]将刺激剂在强碱性条件下用液液萃取的方法进行提纯后，用GC-MS技术进行检测。为提高检测灵敏度，近年来通常采用液相色谱-串联质谱联用技术（LC-MS/MS）检测刺激剂[8-11]和其他禁用物质[12-17]。

图1 本研究4种刺激剂的化学结构式

世界反兴奋剂机构（WADA）曾经于2015年初向各个WADA认可的实验室发了一份列表，询问是否为列表上的刺激剂类禁用物质建立了检测方法。本研究包含的4种刺激剂甲磺美嗪、吗拉宗、贝美格和阿拉明（图1）也包含在此列表中。通过查阅文献得知[18]，甲磺美嗪主要通过尿液排出体外，尿液中大概含56%-89%原形药物。Shintani[19]和Kokot[20]报道用液相色谱法测定甲磺美嗪在血浆中的浓度，检测限为2 ng/mL。Lho 等[21]发表过一篇文章，介绍了使用气相色谱方法检测兔尿和血浆中吗拉宗含量的方法。1991年，Soto-Otero 等[22]曾在文章中介绍过使用液相色谱法测定兔子血清和脑组织中贝美格的浓度。还有文献报道关于阿拉明的液相色谱检测方法的研究[23，24]，而在2000年Hill等报道了使用ACPI源的HPLC-MS/MS方法检测马尿中该药物的含量[25]。

到目前为止，国内外尚未发表有关上述4种刺激剂分别或同时用HPLC-ESI-MS/MS技术的检测方法。因此，为上述4种刺激剂建立灵敏度高、重现性好、专属性强的HPLC-MS/MS检测方法势在必行。

1 实验部分

1.1 主要仪器与装置

1290/6470 Triple Quad LC-MS/MS来自美国安捷伦公司（Agilent Technology）；氮吹仪购自英国比比科技有限公司（Bibby Scientific Ltd）；低速离心机购自北京雷勃尔离心机有限公司；感量0.0001 g电子天平来自瑞士梅特勒-托利多公司（Mettler Toledo）；超纯水系统（Milli-Q Advantage A10）由美国密理博公司生产（Millipore）；GENIE VORTEX-2涡旋混合器由美国科技工业公司制造（Scientific Industries）。

1.2 主要材料与试剂

甲磺美嗪和贝美格来自东京化成工业株式会社；吗拉宗从加拿大全资公司（Toronto Research Chemi⁃cals INC）购得；阿拉明、内标倍可降（mefruside）和色谱纯甲醇购自西格玛奥德里奇科技有限公司；色谱纯甲酸、甲酸铵和乙腈来自美国迪马公司；醋酸铅（分析纯）来自国药集团化学试剂有限公司。

1.3 标准溶液和质控样品溶液的制备

储备溶液：称取一定量的标准品，用甲醇溶解制备成浓度为1 mg/mL的溶液。标准溶液：将储备液用甲醇稀释至10 μg/mL。刺激剂质控样品溶液：在空白尿中用标准溶液倍比稀释制备低、中和高3个浓度的质控样品溶液。

1.4 样品前处理

采用本实验室常规检测刺激剂的方式对尿样进行前处理：用1 mL可调式移液枪准确移取1 mL尿样于10 mL螺口试管中，再加入1 mL浓度为5%的醋酸铅水溶液（其中含有浓度为200 ng/mL的内标），涡旋混匀，以4000转/分钟的速度离心10分钟，倒出上清液，取10 μL进样分析。

1.5 仪器条件

1.5.1 色谱条件

Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，3.5 μm）；采用pH 3.5的甲酸铵缓冲液（A）和乙腈（B）流动相进行梯度洗脱；流速：0.4 mL/min；柱温：40℃；进样体积10 μL。梯度洗脱程序如下：

（1）0.00 min：90%solvent A

（2）5.00 min：90%solvent A

（3）10.00 min：50%solvent A

（4）15.00 min：10%solvent A

（5）16.00 min：10%solvent A

（6）色谱柱平衡时间：4 min

1.5.2 质谱条件

用电喷雾离子源（ESI），采用正离子模式，多反应监测（MRM）模式采集数据。雾化气：20 psi；毛细管电压：3000 V，离子源温度：330℃；干燥气流速：10 L/ min。

2 结果与讨论

2.1 样品的前处理

由于兴奋剂检测大多收集运动员尿样，含有的内源性干扰物质较多，所以通常需要对样品进行前处理，以达到纯化和浓缩样品的目的。样品前处理方案通常需要根据选定的检测方法和药物的结构、理化性质和代谢方式确定。由于大部分刺激剂的代谢方式为原形代谢，所以比较常用的前处理方式为直接进样法。该方法操作简单、快捷，能最大程度地保留尿样中的药物，是较为理想的前处理手段。

2.2 HPLC-MS/MS检测方法的建立

本研究用浓度为1 ng/μL的标准溶液对质谱参数进行优化。通过全扫描发现，4种刺激剂在正离子模式下的灵敏度明显优于负离子。再依次对质谱的加速电压和碰撞电压等进行优化，相关数据参见表1。

表1 4种刺激剂的色谱保留时间和质谱参数

2.3 方法验证

根据WADA实验室国际标准和相关技术文件的要求，我们测定了4种刺激剂的检测限、定量限和线性范围，并验证了方法的日间和日内精密度、准确度、基质干扰效应和方法的特异性等指标。

2.3.1 检测限（LOD） 和定量限（LOQ）

检测限是指对某一特定的分析方法在给定的可靠程度内可以从样品中检测待测物质的最小浓度，通常指信噪比S/N≥3时被测药物的浓度。定量限是指样品中被测物能被定量测定的最低量，其测定结果应具有一定的准确度，一般定义为信噪比S/N≥10时被测药物的浓度。检测限与定量限的测定需要先用一份尿样初略估计，然后在10份不同的空白尿中添加接近或高于估算浓度的标准品进行测定（表2）。与WADA技术文件[26]中规定的刺激剂检测能力最低要求（100 ng/mL）相比，本方法的灵敏度远远超出对兴奋剂样品的检测要求。

2.3.2 线性范围

线性范围指某一方法的校准曲线的直线部分所对应的待测物质浓度变化范围。自LOQ开始向上配制系列浓度的样品，根据上述1.4的描述处理并上机检测，测量直至曲线出现弯曲时的浓度，此时相关系数r2大于0.99。通过测定得知（表3），这4种刺激剂都具有很宽的定量线性范围。

表2 4种刺激剂的方法验证数据

表3 4种刺激剂的线性范围

2.3.3 精密度和准确度

精密度指一组测定的数据之间的接近程度，数据重复测定越接近，显示其精密度越高。准确度是指检测值与真值之间的偏离程度。本实验的精密度和准确度测定是在低、中和高3个浓度级别进行的。在10份空白尿中，分别添加上述3个浓度的标准品，依据1.4的描述进行前处理并上机检测，得出日内精密度。按照日内精密度的操作方法，每天操作1次，共做至少3次，计算得出日间精密度。通过工作曲线计算测量值，与真实值进行比较再乘以百分比，即为准确度（见表2）。

实验结果显示4种刺激剂在3个浓度水平下日内变异系数均小于7.7%，日间变异系数均小于10%，检测的准确度偏差均低于8.2%，符合兴奋剂检测实验室常规检测的要求。

2.3.4 基质效应

尿样中的基质常常对待测物的分析过程有显著干扰，并影响分析结果的准确性，称之为基质效应。在10份不同的空白尿中分别添加低、中和高3个浓度的标准品进行基质效应研究。将空白尿按照上述1.4的描述进行前处理后，在上清液中添加一定浓度的刺激剂和内标，上机检测得到峰面积B。同时，将同体积的纯水经过前处理后，在上清液中添加相同浓度的刺激剂和内标，上机检测得到峰面积A。基质效应的计算方式如下：

基质效应 =刺激剂峰面积B/内标峰面积B÷刺激剂峰面积A/内标峰面积A×100%

表2的实验结果显示，4种刺激剂在低、中和高3个浓度下的基质效应均在可接受范围内（98%～120%）。

2.3.5 特异性

特异性是指在样品介质中有其它组分共存时，检测方法对待测物准确而专属的测定能力。当样品中含有被分析物时呈阳性反应，不含被分析物时呈阴性反应。本研究选择了50份空白尿样，经前处理并上机检测后，发现尿样中基质对待测离子窗口无影响。

3 总结

本研究为WADA拟在检测窗口中增加的4种刺激剂类禁用物质建立了HPLC-ESI-MS/MS检测方法，并对方法进行了全面考察和验证。实验结果显示，该方法不仅具有灵敏度高和线性范围宽等优点，还具有很好的精密度和准确度，抗基质干扰能力和特异性强也为该方法的实际应用打下了良好的基础。目前这4种刺激剂已经添加到我们实验室的常规检测窗口中。

[1]Lho DS，Shin HS，Kang BK，et al.Systematic analysis of stimulants and narcotic analgesics by gas chromatography with nitrogen specific detection and mass spectrometry.J Anal Toxicol，1990，14（2）：73-76.

[2]Merwe PJ，Kruger HSL，Pleterse JW，et al.Report on the doping controlduring the 7th AllAfrica Games in South Africa;Recent advances in doping analysis.Sport and Buch Straub，Koln，2000，8：245-252.

[3]Hemmersbach P，Torre R，Stimulants，narcotics and betablockers：25 yearsofdevelopmentin analyticaltech⁃niques for doping control.J Chromatogr B，1996，687（1）：221-238.

[4]Qiu L，Zheng X，You F，et al.Simultaneous determination of stimulant，narcotics and antiestrogen in urine by gas chromatography-nitrogen phosphorous detection.Se Pu，2009，27（3）：364-367.

[5]Van Thuyne W，Van Eenoo P，Delbeke FT.Comprehen⁃sive screening method for the qualitative detection of nar⁃cotics and stimulants using single step derivatisation.J Chromatogr B，2007，857（2）：259-265.

[6]Van Thuyne W，Van Eenoo P，Delbeke FT.Implementa⁃tion of gas chromatography combined with simultaneously selected ion monitoring and full scan mass spectrometry in doping analysis.J Chromatogr A，2008，210（2）：193-202.

[7]Strano Rossi S，de la Torre X，Botrè F.A fast gas chro⁃matography/mass spectrometry method for the determina⁃tion of stimulants and narcotics in urine.Rapid Commun Mass Spectrom，2010，24（10）：1475-1480.

[8]Hsu KF，Chien KY，Chang-Chien GP，et al.Liquid chro⁃matography-tandem mass spectrometry screening method for the simultaneous detection of stimulants and diuretics in urine.J Anal Toxicol，2011，359（9）：665-674.

[9]Guddat S，Solymos E，Orlovius A，et al.High-throughput screening for various classes of doping agents using a new 'dilute-and-shoot'liquid chromatography-tandem mass spectrometry multi-target approach.Drug Test Anal，2011，3（11-12）：836-850.

[10]Mazzarino M，Fiacco I，de la Torre X，et al.Screening and confirmation analysis of stimulants，narcotics and be⁃ta-adrenergic agents in human urine by hydrophilic inter⁃action liquid chromatography coupled to mass spectrome⁃try.J Chromatogr A，2011，1218（45）：8156-8167.

[11]Girón AJ，Deventer K，Roels K，et al.Development and validation of an open screening method for diuretics，stim⁃ulants and selected compounds in human urine by UH⁃PLC-HRMS for doping control.Anal Chim Acta，2012，721：137-146.

[12]陆江海，秦旸，杨树民，等.采用LC-MS/MS检测人尿中睾内脂方法研究.中国运动医学杂志，2010，29（3）：338-339.

[13]杨志勇，何根业，陆江海，等.液相色谱-串联质谱法定性检测人尿中八种违禁药物.中国运动医学杂志，2014，33 （7）：721-724.

[14]闫宽，马艳华，董颖，等.用液相色谱-串联质谱法检测人尿中三种普坦类兴奋剂控制药物.中国运动医学杂志，2015，34（10）：989-993.

[15]申利，吴筠，杨志勇，等.兴奋剂检测中吗啡和可待因的LC-MS/MS定量方法研究.中国运动医学杂志，2015，34 （11）：1089-1093.

[16]马艳华，闫宽，董颖，等.用液相色谱-串联质谱技术研究禁用物质氢氯噻嗪在人尿中的代谢情况.中国运动医学杂志，2016，35（1）：67-70.

[17]洪宇，徐友宣.阿卡地新（AICAR）的LC-MS/MS检测方法的建立及应用.中国运动医学杂志，2016，35（3）：274-278.

[18]Starke K.Amezinium：A novel pattern of effects on the sympathetic nervous system.Trends Pharmacol Sci，1983，4（6）：269-272.

[19]Shintani H，Hayashi F.HPLC validation of ameziniumme⁃tisulfate in human plasma from uremia patient treated by dialysis.Chromatographia，2001，53：574-578.

[20]Kokot Z，Prawdzik I.Determination of amezinium in plas⁃ma by RP HPLC and its application to bioequicalence studies.Acta Pol Pharm，2001，58（5）：315-318.

[21]Lho D，Shin H，Park J.Simultaneous determination of morazone and phenmetrazine in rat plasma an urine us⁃ing an on-column injection technique with fused-silica capillary column gaschromatography.JAnalToxicol，1990，14（2）：113-115.

[22]Soto-Otero V，Aguilar-Veiga E，Sierra-Marcuno G.Re⁃versed-phase high-performance liquid chromatography method for the determination of bemegride in serum and brain tissue：pharmacokinetics and brain distribution of an intraperitoneal subconvulsive dose in rats.J Pharm Biomed Anal，1991，9（2）：77-182.

[23]田洁，余倩，车宝泉，等.反相高效液相色谱法测定重酒石酸间羟胺及其注射液的有关物质和含量.中国药学杂志，2010，45（17）：1316-1319.

[24]Martin CJ，Saxena SJ.High-performance liquid chromato⁃graphic determination ofmetaraminolbitartrate in the presence of parabens.J Pharm Sci，1980，69（12）：1459-1461.

[25]Hill DW，Hyde WG，Kind AJ，et al.Development of ana⁃lytical methods for the detection of metaraminol in the horse.J Anal Toxicol，2000，24（4）：281-288.

[26]World Anti-Doping Agency：WADA Technical Document. http：//www.wada-ama.org.

The Developed LC-MS/MS Method for the Detection of Four Prohibited Stimulants

Ding Jinglin2，Dong Ying1，Zhang Lijuan2，Zhao Jun2，Ma Yanhua1，Yan Kuan1
1 National Anti-Doping Laboratory，China Anti-Doping Agency，Beijing 100029，China
2 Faculty of Science，Beijing University of Chemical Technology，Beijing 100029，China

Dong Ying，Email：dongying@chinada.cn Zhang Lijuan，Email：dazlj@mail.buct.edu.cn

ObjectiveTo develop and validate a liquid chromatography-tandem mass spectrometry（LCMS/MS）method for the detection of 4 stimulants including amezinium methylsulfate（I），morazone（II），3-ethyl-3-methylglutarimide（III）and metaraminol（IV）to be added to the detection window by World Antidoping Agency.MethodAn equal volume of 5%lead acetate aqueous solution was employed to pre⁃cipitate the proteins in urine samples.After centrifugation for 10 min，the supernatant was introduced directly into the LC-MS/MS system using positive electrospray ionization with multiple reaction monitor⁃ing（MRM）mode.ResultsThe limit of detections（LODs）for stimulants I-IV were 0.1，0.5，5 and 0.5 ng/ mL respectively，while the limit of quantifications（LOQs）were 0.3，1.5，15 and 1.5 ng/mL accordingly. The assays were linear（r2＞0.99）over the concentration ranges of 0.3-5000，1.5-3000，15-3000 and 1.5-4500 ng/mL in human urine respectively.The established method also achieved satisfactory results in terms of intra-and inter-day precisions（CV＜10%），accuracies（bias＜9%），matrix effect（98-120%）and specificity at low，medium and high concentration levels.ConclusionsThe developed method is precise，sensitive and accurate with minimum sample preparation.It is a fit-for-purpose approach and has been applied in the National Anti-Doping Laboratory for doping-control sample analysis.

LC-MS/MS，stimulants，method validation，doping control

2016.4.19

董颖，Email：dongying@chinada.cn；张丽娟，Email：dazlj@mail.buct.edu.cn