外泌体的心血管保护作用及其在运动领域的研究进展

朱启娥 叶啟发 杨翼

1武汉体育学院研究生部（湖北430079）

2湖北科技学院（湖北咸宁437100）

3武汉大学中南医院（湖北430030）

4武汉体育学院健康科学学院（湖北430079）

外泌体的心血管保护作用及其在运动领域的研究进展

朱启娥1，2叶啟发3杨翼4

1武汉体育学院研究生部（湖北430079）

2湖北科技学院（湖北咸宁437100）

3武汉大学中南医院（湖北430030）

4武汉体育学院健康科学学院（湖北430079）

外泌体是由多种细胞分泌的双层膜结构的囊泡样小体，是实现细胞间物质及信息传递的重要媒介物。外泌体对心血管系统作用明显，可能成为心血管损伤潜在的生物标记和治疗靶点。目前认为，外泌体携带的遗传物质微小RNA（microRNA）是其发挥生物学功能的关键物质，其中miR-126可促进血管新生和损伤修复，而miR-155、miR-143、miR-145则在心血管病理过程中高表达。运动导致循环系统外泌体数量迅速增加可能是运动促进心血管健康的调控靶标。

外泌体；微小RNA；心血管疾病；运动；调控

外泌体（exosomes，EXs）是由细胞分泌的纳米级双层膜囊泡，绝大多数EXs直径介于40～100 nm之间[1，2]，由Johnstone等[3]于上世纪八十年代发现并命名。由于受到检测技术的限制，EXs被发现后的十余年间并未得到广泛的研究与重视，直至纳米分析技术的成熟运用才为研究EXs提供了条件，使得这个微小的膜囊泡逐渐成为生物和医学领域研究的热点。人们发现，EXs与很多病理情况密切相关，如肿瘤细胞分泌的EXs会促进肿瘤的生长和转移，而肿瘤周围组织分泌的EXs则具有杀伤肿瘤细胞的能力[4]，随着对EXs研究的不断深入，EXs在心血管疾病中的生物学作用也日益受到广泛关注。鉴于心血管疾病的普遍高发和严重性，以及运动在防治心血管疾病中的重要作用，本文对EXs在心血管疾病中的保护作用及其在运动领域的研究进展做一综述。

1 外泌体概述

细胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）是细胞分泌释放的一类具有生物学活性的小囊泡，可分为细胞膜微囊泡（microvesicles，MVs）和外泌体（exosomes，EXs）两大类[5]，可根据其大小和内容物进行鉴别，MVs 比EXs稍大，直径介于100～1000 nm之间[2]。EXs的关注度较高，它由脂双层膜围绕，并携带一些蛋白质和遗传物质；EXs的膜脂成分与细胞膜不同，包括胆固醇、甘油二酯、鞘脂、磷脂、甘油磷脂、聚甘油磷脂等，这使得EXs膜比质膜更具刚性，膜上还有前列腺素、白三烯等生物活性物质和产生脂质的酶。EXs膜脂成分除具有结构功能外，还能够在其生物发生过程中实现对神经酰胺的传递[6]，并且具有识别和内化的作用[7]。EXs中最常见的是膜转运蛋白和膜融合蛋白，如CD63、CD81、CD82、CD9、某些热休克蛋白、GTP酶，还有骨架蛋白、信号蛋白、白蛋白等。蛋白表达水平与母细胞类型和环境条件有关，主要组织相容性复合体（major his⁃tocompatibility complexes，MHCs）也是EXs膜上的重要标志物。EXs中还含有丰富的RNA，如miRNA和tRNA，EXs中RNA种类和数量也与母细胞类型有关，但并不完全取决于母细胞本身RNA特征[8-10]，目前为止，对EXs中RNA分选、包装和释放过程还知之甚少。

多种细胞均可分泌EXs，如间充质干细胞、T细胞、B细胞、自然杀伤细胞、肿瘤细胞等。分泌从细胞质膜的内陷开始，第一次内陷产生内泌体（endosomes），第二次是内泌体膜内陷，产生多囊泡体（multi-vesicular bodies，MVBs），MVBs腔内囊泡即为外泌体前体，当MVBs膜与细胞质膜融合时，外泌体前体被释放进入胞外空间，即成为外泌体（图1）。细胞释放EXs与其所处的环境有关，如T细胞释放EXs与T细胞受体活性有关[11]，当与同源T细胞相互作用时，B细胞会增加EXs的释放[12]。EXs可出现在多种体液中，如血液、尿液、乳汁、关节滑液、羊膜液等。通过膜融合、内吞作用或受体调节的内陷作用，EXs得以进入受体细胞[13]。

作为信号分子，EXs在细胞间相互交流中扮演重要角色。由于EXs仍保留有母细胞的大部分生物特征，并与其所包含的特异性内容物及所处的微环境密切相关，所以不同细胞来源的EXs功能具有特异性。它既能在分泌细胞附近发挥作用，又能随血液循环至靶细胞而实现长距离的信号传递。EXs可穿过血脑屏障[14，15]，其内容物miRNA可不被RNase降解[8]。可见，EXs在细胞间传递信息有其自身的特点与优势。通常，可使用离心和过滤的方法初步收集细胞外囊泡，再根据EXs直径大小利用纳米示踪技术和透射电镜进一步筛选，最后根据EXs所含的标志蛋白，利用蛋白质免疫印迹技术对其进行定性和半定量测定，EXs的研究技术也处于快速发展和进步之中。

图1 外泌体形成过程示意图（引自Turturici等[13]的文献，略做修改）

2 外泌体对心血管的保护作用

2.1 外泌体与心肌损伤

来源于各种干细胞，如心脏干细胞（cardiac pro⁃genitor cells，CPCs）、间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）、造血干细胞（hematopoietic stem cells，HSCs）的EXs和缺血预适应过程中循环EXs对心肌具有保护作用，而处于病理状态的细胞分泌的EXs则有相反作用。有研究证实，CPC-EXs能以旁分泌的方式激活抗凋亡信号，阻止心肌凋亡并改善损伤后的心功能[16]。体外研究也发现，CPC-EXs减轻了氧化应激诱导的Caspase3/7的活性，若将CPC-EXs运送至成人缺血再灌注损伤模型中，对细胞凋亡有明显的抑制效果[17]。可见，用CPC-EXs处理缺血再灌注损伤的心肌，可减轻心肌损伤，改善心肌功能，但CPC-EXs发挥修复作用的内容物及具体机制都有待进一步阐明。Arslan等[18]发现MSC-EXs能够减少小鼠缺血再灌注导致心肌损伤的面积和减轻炎症反应，并认为MSC-EXs治疗心肌损伤潜力很大。HSCs能够改善心脏机能，这在动物模型和人类疾病中都已得到证实。Sahoo等[19]观察到，与CD34+干细胞相同，CD34+-EXs可通过增强内皮细胞活性、增殖和管形成能力而促进血管再生。可见，CD34+干细胞发挥功能与CD34+-EXs密切相关。与此观点相似，有研究认为[20，21]，CD34+细胞在缺血再灌注后发挥有益作用可能是通过CD34+-EXs调节血管再生因子传递至周围细胞而引发的。

EXs作为囊泡家族的重要成员，广泛参与母细胞与受体细胞的信息交流，进而影响受体细胞的生物学功能。研究表明，EXs在心肌修复中起关键作用[22，23]，并被认为是治疗心肌损伤的潜在靶点[22]。现已证实，缺血预适应对心肌缺血再灌注损伤具有明显的保护作用，但确切机制仍未阐明。据报道，在心肌缺血预适应过程中，血浆EXs水平升高，而且，此时分泌的EXs中富含IGF-1受体和miR-29c[24]。胰岛素样生长因子1 （insulin-like growth factor 1，IGF-1）在促进组织生长及修复中的积极作用是确切的，而miR-29c也已被证明具有抗肝纤维化的作用，这或许就是缺血预适应的保护机制之一。心肌重塑的机制十分复杂，尚未完全了解清楚。有研究认为，EXs在心肌重塑中起着重要作用[25]，其发挥作用是通过在祖细胞与心肌细胞之间扮演信使的角色实现的[23，25]。尽管EXs在心肌修复与重塑中发挥重要作用，但其作用机制还不清楚，值得深入研究，以发掘更多的抗心肌损伤途径。

2.2 外泌体与血管损伤

EXs在肿瘤等多种疾病中发挥有益效应，但其对血管修复与再生的作用报道较少。Chen等[26]认为，来自于细胞膜的小囊泡包含EXs，是治疗血管疾病的潜在靶点。Li等[27]从人脐带血中分离出来自于内皮祖细胞（endothelialprogentitorcell，EPC）的 EXs（EPCEXs），并观察其对大鼠血管损伤的影响，结果表明，EPC-EXs能够被优先募集到血管的受损部位，并被内化至内皮细胞，产生强烈的再生效应，在血管损伤早期加速再内皮化，并且EPC-EXs能够调节多种血管生成相关基因的表达，通过积极调节内皮细胞功能而减轻血管损伤。Kalani等[28]将用同型半胱氨酸处理的大鼠脑内皮细胞作为脑血管损伤模型，观察姜黄素处理的细胞分泌的EXs对其的影响，发现EXs减轻了氧化应激和由高同型半胱氨酸水平诱导的内皮细胞损伤而致的高内皮细胞膜渗透性，并认为姜黄素处理的EXs有可能成为治疗脑部疾病的潜在方法。此外，有报道认为，EPC-Exs可通过增强内皮细胞功能而促进血管修复[27]。EXs对心血管的保护作用如图2所示。

3 外泌体是心血管损伤的潜在标记物

EXs及其内容物对感染等应激非常敏感，心血管组织在受损情况下可加速分泌EXs，此时EXs作为组织损伤的促进因素而使病情恶化。有研究发现，心肌细胞在应激情况下会上调EXs的分泌量并改变其内容物成分，使其中富含促炎症因子和促凋亡因子，如热休克蛋白60（heat shock protein60，HSP60）和肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）[30]，这些因素会进一步加剧炎症反应，扩大受损面积和导致细胞死亡。成纤维细胞是构成心肌的主要成分，致病性EXs对其表型的调控作用也非常明显。有研究证实，成纤维细胞分泌的EXs诱导了心肌肥大发生[31]。在2型糖尿病心血管病变中，高血糖改变了EXs的释放量，2型糖尿病大鼠血清EXs中富含miR-320，这些miR-320被内皮细胞吸收后，会阻止内皮细胞的增殖、迁移和管形成，如果加入EXs生物合成抑制剂GW4869，则不会出现上述结果[32]。上述研究充分表明了EXs可作为心血管损伤的潜在标记物，但是对于不同损伤类型的特定标记物的确定和评价方法仍需更多的数据加以佐证。

图2 外泌体心血管保护作用示意图（引自Ailawadi等[29]的文献，略做修改）

4 外泌体中发挥心血管保护作用的miRNA

EXs功能的发挥与其内容物蛋白质，以及mRNA、miRNA的传递作用密切相关。miRNA是长度约19～22个核苷酸的非编码RNA，通过与mRNA的3’端非编码区相结合而调节基因表达，是翻译后水平调节的重要机制，参与细胞增殖、迁移、分化、凋亡等多种生物学过程。一个miRNA能够调节几百个mRNA和蛋白质的表达[33，34]，因此在许多生理病理过程中发挥重要作用。EXs能吸收一些miRNA并将其运送至靶细胞，也能释放miRNA进入循环系统。一些研究表明，EXs通过传递miRNA实现细胞间的相互交流[35，36]，但其细胞来源及具体作用机制有待阐明。

4.1 miR-126

EXs携带的miRNA中，miR-126和miR-155与心血管损伤和修复的关系最为密切。miR-126是内皮特异性miRNA，在血管再生的控制和保持血管完整性方面的作用已被公认[37-39]，可促进血管新生，并与新生血管的存活、形成和维持有关，在促血管生成因子中高表达[38，39]，这些对于损伤组织的修复是必不可少的。内皮祖细胞（EPCs）、内皮细胞（endothelial cells，ECs）、平滑肌细胞（smooth muscle cells，SMCs）间的正常交流对于保障血管稳态平衡至关重要，miR-126能够维持这些细胞的正常功能。体外研究发现，miR-126可调节多种与ECs生物活性相关的生理过程，包括细胞迁移、细胞骨架的组织、毛细血管的稳定性及细胞存活；在体内，敲除斑马鱼的miR-126会导致血管完整性缺失和大出血[37，40，41]。上述研究结果表明，miR-126可促进损伤组织修复，在心血管损伤中可起到有益作用。

4.2 miR-155

miR-155参与多种疾病的发生和发展，如肿瘤、免疫和炎症反应，其作用与miR-126恰好相反，在一些病理情况下高表达。炎症因子TNF-α可促使成纤维细胞、巨噬细胞中miR-155表达上调[42]，糖尿病患者肾脏及高糖处理的人肾小球内皮细胞损伤模型中miR-155表达也上调[43]。有研究认为，miR-155的靶基因是内皮细胞一氧化氮合酶（endothelial cells nitric oxide syn⁃thase，eNOS），在人脐静脉ECs中过表达miR-155可使eNOS表达下调，进而导致NO含量下降，最终使血管舒张功能受损[44]。可见，miR-155在损伤组织中高表达，可加重组织功能受损，不利于心血管损伤的修复。

4.3 其它miRNA

据报道，EXs中miR-143和miR-145水平变化与血管功能异常有关[45，46]。心血管病变是糖尿病的主要并发症，有半数以上糖尿病患者死于心血管疾病。2型糖尿病患者血液及平滑肌中miR-143和miR-145水平升高，miR-143和miR-145通过作用于抑癌基因人类Krüppel样因子4（Krüppel-like factor 4，KLF-4）和IGF-1而影响血管平滑肌的正常功能[47]，高糖及炎症因子TNF-α均可使miR-143和miR-145表达上调[48]，可见miR-143和miR-145在糖尿病血管稳态失衡中发挥重要作用。此外，EXs中miR-22、miR-34a对心肌缺血再灌注损伤也具有保护作用[49，50]。

5 运动对外泌体的调控作用

5.1 运动对EXs释放的影响

运动对EXs影响的研究刚刚开始，主要集中于循环系统EXs，运动可使EXs生理释放量增多。运动期间，红细胞、单核细胞、内皮细胞、神经细胞都释放EXs，导致循环系统EXs增加。有学者研究了运动中EXs的释放动力学，结果表明：EXs的释放时间早于个体乳酸阈，释放速度也快于肾上腺素和去甲肾上腺素[51-53]。故EXs在运动起始阶段即已开始释放，与乳酸的大量堆积没有直接联系。HSP70和游离DNA（cellfree DNA，cfDNA）都是运动后被释放进入循环系统的物质。HSP70是急性运动应激反应的可靠标记物[54，55]，cfDNA与过度训练和运动疲劳有关，其在运动后增加的特征与血乳酸相似[56]。研究者们对运动后EXs和HSP70、cfDNA的释放情况进行了观察。Beninson等[57]在检测尾部电刺激大鼠血液中EXs和HSP70时发现，EXs的释放先于HSP70，后者的释放对EXs具有依赖性。一项对人在递增负荷运动中EXs和cfDNA的研究也认为EXs的释放快于cfDNA[58]。

EXs的恢复动力学与运动方式有关。Frühbeis等[58]对12名每周至少进行3次运动的健康男性志愿者进行递增负荷跑台和功率自行车运动实验，结果发现两种运动方式均能导致EXs快速释放，但骑车运动后90 min恢复期内EXs能较快清除，而跑台运动后EXs水平比较稳定，90 min内未见明显清除，并认为EXs可能是运动调节和适应过程中潜在的长距离信号分子。

上述研究表明，EXs在运动中被大量释放，且在运动早期即被激发，释放速度也快于HSP70和cfDNA，EXs的恢复与运动方式有关，可见EXs对运动应激非常敏感，并且其变化具有自身特点。虽然EXs在运动中的具体作用还不十分明确，但运动造成的身体应激状态很可能是导致EXs释放的因素，这或许也是机体对运动应激的适应性反应。

5.2 运动调节EXs及对心血管的保护作用

虽然运动导致EXs大量释放的具体机制并不清楚，但目前主流观点认为EXs的大量释放可减轻心血管疾病，对机体健康有利。Fiuza-Luces等[59]观察了运动对EXs的影响和糖尿病心血管并发症的疗效，认为运动导致EXs的释放可减轻糖尿病心血管并发症。Hergenreider等[60]的研究结果表明，运动可刺激EXs大量释放，并从ECs传递至平滑肌细胞（smooth muscle cells，SMCs），具有调节抗动脉粥样硬化的作用。运动不但能够通过促进EXs的分泌而实现对心血管的保护，并且能够通过调节miRNA的数量而对心血管发挥有益作用。Fernandes等[61]对12周龄雄性高血压大鼠进行了为期10周的游泳耐力训练，结果发现耐力运动使比目鱼肌中miR-16和miR-21水平降低，miR-126水平升高，这种变化与血管再生之间存在明显相关性，表明血管的新生依赖于耐力运动带来的miRNA水平变化。另有研究表明，运动训练通过增加EXs的分泌量而使基质金属蛋白酶9（matrix metalloprotein-9，MMP9）沉默，进而抑制病理性心肌重塑[62]。目前并无有效方法控制病理性心肌重塑，运动或许能够作为MMP9的抑制物质而减轻心肌损伤。

由此可见，运动可通过调节EXs和miRNA的水平而发挥对心血管的保护作用，是运动促进心血管健康的又一途径，这或许是运动诱导的心血管保护效应的潜在机制。

6 总结

EXs对心血管的保护作用中，其内容物miRNA是关键物质，对miRNA的功能已经有较多了解，进一步的研究可关注EXs释放miRNA和受体细胞吸收的机制，miRNA导致受体细胞发生的分子变化以及miRNA的调控方法。运动能够对EXs产生影响，目前国内外对EXs与运动关系的相关研究还不是很多，因此有许多问题亟待解决，如EXs能否作为心血管损伤程度与恢复情况的分子标志，发挥心血管保护作用的EXs其细胞来源与具体修复机制如何，不同运动方式及运动强度对EXs数量、来源、特征成分及作用靶点的调控作用，以及它们在运动促进健康中的调节作用也值得深入研究。对上述问题的深入研究将有助于人们更加充分了解EXs的生物功能和调控机制，不但有望发现新的细胞信号传导途径，而且有望发现该途径与病理状态的相关性，为今后探索经由EXs途径预防心血管疾病或促进心血管修复提供理论依据与实践指导。

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2016.03.20

湖北省自然科学基金重点项目（2015CFA084）；湖北省高等学校优秀中青年科技创新团队项目（T201523）；武汉体育学院科研合作基金项目（2016XH24）

杨翼，Email：yangyi999999@foxmail.com