运动对生长期大鼠外周血单个核细胞中wnt途径相关骨重塑基因的影响

杨永杰 高丽 章岚 陈万 李向东 陈岩 王朝晖 沈东颖

1 山东体育学院（济南 250102）

2 山东省千佛山医院

运动对生长期大鼠外周血单个核细胞中wnt途径相关骨重塑基因的影响

杨永杰1高丽1章岚1陈万1李向东2陈岩1王朝晖1沈东颖1

1 山东体育学院（济南 250102）

2 山东省千佛山医院

目的：研究水平跑台训练后生长期大鼠外周血单个核细胞（PBMC）中wnt信号途径的Jun、Mmp9、Cox2、Tnf和Msx2 mRNA表达水平，揭示其与骨重塑的关系。方法：24只2月龄SD雄性大鼠随机分成对照组（n=12）和运动组（n=12），运动组以25 m/min，50 min/d，5 d/w水平跑台运动12 w；训练结束进行大鼠体重、全身肌肉含量、整体BMD和BMC检测，股骨BMD和骨形态学测量，Micro-CT扫描观察股骨远端松质骨骨微结构；分离PBMC，QRT-PCR检测其Jun、Mmp9、Cox2、Tnf和Msx2 mRNA表达。结果：与对照组相比，运动组大鼠除了体重显著下降外，全身肌肉含量、整体BMD、BMC和股骨BMD增加，但均不具有统计学意义；股骨长度、厚度和宽度均无显著性变化；股骨远端松质骨骨微结构参数除骨小梁数量（Tb.N）和骨小梁分离度（Tb.Sp）无显著性变化外，骨体积分数（BV/TV）和骨小梁厚度（Tb.Th）显著增加（P＜0.05），骨表面积和体积比（BS/BV）及骨小梁模式因子（Tb.Pf）显著降低（P＜0.05）；股骨远端松质骨骨小梁数量增多，小梁间隔小、断裂少；大鼠PBMC中Msx2 mRNA表达上调，Jun、Mmp9和Cox-2 mRNA表达下调，Tnf无表达差异。结论：运动后PBMC中Jun、Mmp9、Cox2、Tnf和Msx2 mRNA表达变化与骨重塑变化一致，提示上述基因可作为反映运动对骨重塑影响的候选分子标记。

生长期大鼠；跑台运动；PBMC；骨重塑；wnt

青春期是骨骼发育的关键时期，适宜的机械负荷是增加骨量最有效的方式之一。由于骨的重塑过程进展缓慢，对骨量和骨密度的检测不能实时反映运动对骨重塑的干预。目前分子标记在实时预测骨重塑上更占优势，但体育锻炼等机械应力下能反映骨吸收和骨形成的分子标记尚待研究。据报道原癌基因（c-Jun）、基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinase，Mmp9）、前列腺素环氧合酶-2（Prostaglandin synthase 2，Ptgs 2或Cyclooxygenase-2，Cox-2）、肿瘤坏死因子α（Tumor ne⁃crosis factor-α，Tnf-α）和Msh同源异形基因2（Msh ho⁃meobox 2，Msx2）参与Wnt信号途径，并对骨重塑起作用[1-3]。Wnt/β-catenin信号是骨合成的重要信号，该信号被阻断可导致骨质疏松。其中c-Jun和Cox2是wnt信号的下游靶基因[2]；Mmp9是反映骨重塑的关键酶[4]，通过Cox-2间接受到wnt信号的调控[3]；Tnf抑制Wnt通路介导的全身骨形成和局部骨修复[1]；Msx2增强Wnt信号促进成骨分化[5]。

外周血单个核细胞（peripheral blood mononucle⁃ar cell，PBMC）主要指淋巴细胞和单核细胞，与骨重塑密切相关[6，7]，与骨组织相比PBMC具有易获得、创伤小、可反复获取等优点。目前应力诱导PBMC基因表达改变[8-10]与骨重塑关系的研究多集中于细胞因子和免疫方面，研究对象多为各种原因导致的骨质疏松模型，以健康机体作为研究对象的很少。本研究以2月龄雄性SD大鼠作为研究对象，经12周跑台训练，研究大鼠骨密度、骨微结构和股骨形态学变化，分离大鼠PBMC并检测wnt信号途径中Jun、Mmp9、Cox2、Tnf和Msx2基因的mRNA表达，寻找PBMC中对运动敏感的骨重塑基因，为运动健骨提供形态学和分子水平的依据。

1 研究对象与方法

1.1 动物分组

2月龄雄性SD大鼠24只，体重247.9±8.0 g，购自中国医学科学院医学实验动物研究所，生产许可证SCXK（京）2009-0004，动物批号11401300010335，使用许可证SYXK（京）2011-0034。动物单笼饲养，自由进食、饮水，以国家标准啮齿类动物常规饲料喂养。环境温度24±2℃，相对湿度55% ±5%，每天光照时间12 h。适应性喂养2天后随机分为对照组（n=12）和运动组（n=12）。

1.2 运动方案

参照Bedford[11]运动负荷的制定标准制定运动方案。对照组自然笼养，运动组大鼠在动物跑台（安徽淮北正华生物仪器设备有限公司，ZH-PT）上进行水平跑训练12周：第1周从10 m/min，10 min/d，逐渐增加到15 m/min，30 min/d；第2周逐渐增加到15 m/min，40 min/d；第3周逐渐增加到20 m/min，50 min/d；第4周逐渐增加到25 m/min，50 min/d，维持25 m/min，50 min/ d这一强度至第12周，每周运动5 d。见表1。

表1 大鼠运动方案

1.3 股骨的获取、骨密度检测、股骨形态测量及骨微结构观察

最后一次运动训练结束后，利用双能X射线骨密度仪（DEXA，XR-600）检测大鼠体重、全身肌肉含量、整体骨密度（BMD）和骨矿含量（BMC）；并于运动结束24 h后，乙醚麻醉并处死大鼠，剥离右侧股骨，测量离体股骨的远端骨密度（BMDff）和中端骨密度（BMDfm），股骨密度检测如图1所示。游标卡尺（精确到0.02mm）测量股骨长度及股骨近端、中段和远端的厚度与宽度。用Skyscan1076 micro-CT扫描，将新鲜的股骨沿长轴平行于扫描床长轴放置，对距股骨远端2 cm的区域扫描，层间距18 μm。兴趣区定位于股骨远端生长板刚消失后开始上方100层的区域范围内。以micro-CT自带软件进行定量分析，获得大鼠股骨松质骨骨微结构参数：骨体积分数（bone volume/total volume，BV/ TV，%）、骨表面积和体积比（bone surface area/bone vol⁃ume，BS/BV，μm-1）、骨小梁厚度（trabecularthickness，Tb. Th，μm）、骨小梁数量（trabeculae number，Tb.N，μm-1）、骨小梁分离度（trabecular spacing，Tb.Sp，μm）、骨小梁模式因子（trabeculae patternfactor，Tb.Pf，μm-1）。采用Spss11.1统计处理软件对形态学数据进行分析，所有数据采用平均值±标准差（±s）表示，两组指标之间差异采用独立样本t检验统计分析，以P＜0.05为差异显著。

图1 双能X射线吸收法测量股骨骨密度的区域

1.4 外周血液PBMC提取、总RNA的提取和QRT PCR检测

最后一次运动训练结束24 h后，腹主动脉取血。为平衡个体差异把同组的随机5只大鼠血液等量充分混合后，取2 ml，加入3 ml大鼠 Ficoll-Paque（GE healthcare），室温400×g水平离心20 min，吸取分离液层及单个核细胞层。D-PBS清洗2次，250×g离心10 min获得纯PBMC。

利用总RNA提取试剂盒RNeasy Fibrous Tissue （OMEGA）提取外周血PBMC的C-Bmix、L-Bmix总mRNA，用 DNAase处理清除基因组DNA，利用QUANT-IT RNA ASSAY KIT（invitrogen）质检（A260/ A280≥1.90；总量≥1 μg）。用Primer5.0软件设计引物，用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（Fermen⁃tas）将纯化的总RNA（500 ng）反转录为cDNA。 加0.5 uM primers，35个循环，溶解温度60℃，以β-actin作为参照，在实时定量PCR仪（Bio-Rad）用SYBR-Green （Roche）进行QRT-PCR，扩增的mRNA水平用2-△△CT表示，且2-△△CT值＞2（或＜0.5）为表达具有显著性差异。

2 结果

2.1 运动结束后两组大鼠体重、肌肉含量、骨密度、骨矿含量和股骨形态的比较

由表2可知：12周水平跑台训练后，运动组大鼠体重显著低于对照组；整体BMD和BMC、股骨BMD（股骨远端骨密度和股骨中部骨密度）及全身肌肉含量高于对照组，但均不具有统计学意义。股骨长度、厚度和宽度均略有变化，但都不具有统计学意义。上述结果表明该强度的持续耐力运动对健康生长期雄性大鼠的全身肌肉含量、BMD、BMC及股骨形态影响不显著。

表2 两组大鼠体重、肌肉含量、骨密度、骨矿含量和股骨形态比较

2.2 大鼠股骨远端松质骨micro-CT扫描的骨微结构观察

通过Micro-CT扫描获得大鼠股骨远端骨松质骨微结构2D结构参数（见图2），运动组股骨远端松质骨的BV/ TV、Tb.Th和Tb.N均高于对照组，其中BV/TV和Tb.Th存在显著差异（P＜0.05）；Tb.Sp有下降趋势（P＞0.05），BS/ BV和Tb.Pf显著性降低（P＜0.05）。

运动组和对照组大鼠股骨远端micro-CT骨扫描的二维切片图（图3）显示，运动组股骨远端松质骨骨小梁排列呈密集网状，骨小梁数量增多、小梁间隔小，骨小梁断裂少，提示12周跑台运动对骨微结构有促进作用。

2.3 QRT-PCR检测Mmp9、Cox2、Jun、Tnf和Msx2基因mRNA 的表达变化

与对照组相比，运动组Jun、Mmp9和Cox2的mRNA表达下降，表达变化倍数分别为0.18（即降低5.56）、0.39（即降低2.56）和0.1（即降低10）；二组间Tnf的mRNA表达无显著性差异，表达倍数为0.63（即降低1.58）；运动组Msx2的mRNA表达上调，表达变化倍数为12.67，其中Jun、Cox2和Msx2基因表达变化幅度大，表达变化倍数大于5倍。见表3。

表3 运动结束后大鼠PBMC中Jun、Mmp9、Cox2、Tnf和Msx2的mRNA表达水平比较

3 讨论

3.1 跑台运动对生长期大鼠体重、全身肌肉含量、BMD、BMC 和股骨形态的影响

对人和动物的实验证明生长期合理的耐力运动均使骨形成增加。有研究证明成骨负荷主要源于肌肉的主动收缩而不是体重。本研究中运动组大鼠体重显著下降，而全身肌肉含量变化无统计学意义；骨密度和骨矿含量也均未检测到有统计学意义的变化。推测在一定肌力范围内，成骨与破骨相对平衡，骨量不变。另外，峰值骨量主要受控于遗传，运动可能只影响预期骨量最大值的最终获得及获得的速度，骨的力学强度增加是骨质改善的本质特征。除骨量外，骨小梁的结构变化对骨强度起着重要作用。对大鼠股骨远端的Mi⁃cro-CT扫描结果发现，与对照组相比，水平跑台训练后尽管股骨远端骨密度没有发生显著性变化，但其骨微结构如骨体积分数、骨小梁厚度、骨表面积和体积比及骨小梁模式因子都发生了显著性变化（P＜0.05），骨微结构改善。Ju等以尾吊致骨质疏松的Wistar大鼠为模型，以25 m/min、60 min/d、5 d/w运动5 w，发现运动组大鼠右股骨骨密度、骨微结构都有不同程度的改善[12]。我们的骨微结构结果与Ju等报道的结果一致[12]。至于骨密度结果不同可能与测量部位、测量方法及动物年龄等因素的差异有关。在骨微结构改善的同时骨骼长度及厚度协调增长，将对充分积累峰值骨量有利。为此，我们对股骨的长度形态学指标进行分析，结果表明锻炼没有影响大鼠纵向骨生长，这与其他研究[13]一致。但也有运动抑制或增加纵向骨生长的不同报道。本实验中股骨形态无显著变化可能与负载条件以及动物年龄有关。本实验对象为正常生长期的大鼠，各组大鼠骨骼在实验过程中均在快速生长，运动对骨长度、厚度和宽度等的影响可能需要更长的时间才可检测到。上述结果表明生长期大鼠跑台训练后骨质有所改善，同时也进一步证明骨量、骨密度和骨形态等指标的检测灵敏度低，不能实时反映运动对骨重塑的干预。

3.2 跑台运动后Jun、Mmp9、Cox2、Tnf 和Msx2 表达水平

核因子κB受体活化因子（receptor activator of nu⁃clear factor-κB，RANK）、细胞核因子-κB受体活化因子配体（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）和护骨素（osteoprotegerin，OPG）是决定骨量的重要因素。调节OPG/RANK/RANKL通路可维持骨重塑的动态平衡。Wnt/β-catenin信号是骨合成的重要信号，位于OPG/RANK/RANKL通路上游调节骨重塑。基因Jun、Mmp9、Cox2、Tnf和Msx2参与Wnt途径调节骨重塑过程[1-3，5]。

3.2.1 跑台运动后Jun、Mmp9和Cox2表达水平对骨重塑的影响

Jun、Mmp9和Cox2是wnt信号的下游靶基因[2，3]。RANKL与受体结合激活c-Jun。Jun组成AP-1（fos/ Jun的二聚体），许多骨形成相关基因的启动子序列中均含AP-1结合位点，在长骨生长过程中起重要作用。AP-1也调节破骨细胞分化，参与破骨细胞分化的关键基因NFATc1的转录激活[14]。Mmp9是反映骨重塑的关键酶，发挥骨吸收作用[4]。Mmp9表达水平与骨吸收活性有关，抑制破骨细胞分化Mmp9表达降低。Mmp9因参与调节巨噬细胞极化的细胞因子的蛋白水解间接地调节巨噬细胞分化[15，16]。Cox-2是合成前列腺素如PGE2等的限速酶。Cox-2/PGE-2/RANKL是骨吸收的重要信号之一。低浓度的 PGE-2促成骨细胞增殖，促进骨形成；高浓度PGE-2促进破骨细胞转化，刺激骨吸收，其剂量受 Cox-2的调节[17-19]。

运动等应力刺激促进骨重塑。体内、体外实验表明机械负荷可以激活 Wnt/β-catenin信号[20，21]，促使下游目的基因 Cox-2、c-Fos、c-Jun等表达[2]。骨组织的成骨细胞及破骨细胞前体细胞表达Cox-2，调节PGE2对骨发挥作用。长期持续应力和过度应力刺激作用下，Cox-2/PGE-2生成呈正反馈积累，高浓度的PGE-2刺激成骨细胞分泌大量的 RANKL，导致破骨细胞活性增强，骨强度下降，骨损伤易感性增高。同时c-Jun和c-Fos通过Wnt/β-catenin信号激活，也被大量表达，参与破骨细胞的分化。有报道Cox-2高表达可通过刺激血小板活化因子而诱导Mmp 9表达，促进细胞外基质降解，启动骨吸收[3]。在本实验中，运动组大鼠PBMC 中Jun、Mmp9和Cox-2的mRNA表达均下降。这可能是运动组大鼠对应力刺激敏感性下降，觅食活动等低强度的机械应力刺激对Cox-2生成的刺激能力减弱。同时运动结束24 h后，运动训练刺激诱导的促破骨的基因表达效应消失，导致Jun、Mmp9和 Cox-2的mRNA表达下降。 Cox-2表达的下降可通过降低PGE-2促进骨形成。这在骨微结构改善中得以证实。

3.2.2 跑台运动后Tnf 表达水平对骨重塑的影响

Tnf-α是由单核巨噬细胞释放的骨吸收细胞因子，对成骨细胞有抑制作用[22]。Dickkopf1（Dkk1）是Wnt信号通路的天然拮抗物。Dkk1过表达可减少OPG的表达，从而增强RANKL发挥诱导破骨细胞分化的生物学效应。据报道Tnf可诱导DKK-1表达，抑制通过Wnt通路介导的全身骨形成和局部骨修复[1]。Tnf可促进RANKL表达促进破骨细胞分化和活化[22]。不同运动负荷对Tnf-α的影响有不同观点，Bernecker等[23]的研究发现运动引起血浆Tnf-α升高，而外周血单个核细胞中TNF-αmRNA表达水平在运动前后则无显著性差异，提示血浆内TNF-α升高与外周血单个核细胞无关。另有报道[10]普拉提运动后PBMC的Tnf-α表达升高。这种研究结果的不同可能与运动强度有关。低于阈值的强度Tnf-α mRNA表达不升高[24]。只要高于阈值的强度才能使Tnf-α mRNA表达相应运动而增加。我们用QRT-PCR没有在外周血中检测到Tnf-α mRNA表达变化，可能与运动强度和检测时间有关；另外，本实验没有对血浆Tnf-α进行检测，在该实验条件下血浆Tnfα变化与骨重塑及其在PBMC中表达量之间的关系尚需研究。Tnf-α mRNA表达水平揭示运动后24 h骨吸收不占优势，这与骨质改善相符合。

3.2.3 跑台运动后Msx2表达水平对骨重塑的影响

Msx2可通过减少Dkk1的表达调节骨发育，以增强Wnt信号促进成骨分化[5]。据报道Msx2在骨形成的早期阶段起作用，在骨形成的后期作用则减少[25]。在体外，Msx2促进干细胞的成骨。Msx2转基因小鼠成骨细胞数量增加，骨形成增加[5]。应力刺激影响Msx2表达的研究尚少。据研究Msx2对张压应力作用敏感，周期性张应力可以抑制牙周膜干细胞 Msx2 mRNA表达[26]。但牙周膜在机械应力作用后的恢复期牙周成纤维细胞，成牙骨质以及成骨细胞的Msx2随着时间的推移表达增强，在机械应力后24 h后成骨细胞依然表现出较强Msx2表达[27]。与已有报道一致，我们检测到运动后24 h PBMC中Msx2 mRNA表达增加，表明此时机体内环境有利于骨形成，这与骨微结构结果相符合。

由上可知，PBMC中Tnf、Jun、Mmp9、Cox2和Msx2 mRNA表达不管是上调、下调，还是无显著性表达差异，都与骨质变化相符。其中Jun基因表达变化超过5倍，Cox2和Msx2基因表达变化≥10倍。本实验没有检测到运动对骨量、骨密度及骨形态等产生统计学意义上的变化。PBMC中Tnf、Jun、Mmp9、Cox2和Msx2表达水平能够更灵敏反映运动对骨重塑的影响。但上述基因表达对运动的敏感性及其与骨重塑的关系尚需进一步研究。此外，我们对运动后PBMC中Jun、Mmp9、Cox2和Msx2的mRNA表达与骨重塑的关系进行了报道。PBMC取材具有易获得、创伤小、可反复获取的优点，该研究为运动影响骨重塑的组织取材提供了思路，也为运动影响骨重塑提供了分子生物学资料。

4 总结

生长期大鼠跑台运动12 w后BMD、BMC、股骨形态变化不明显；而骨微结构显示骨小梁排列密集，骨小梁数量增多、小梁间隔小，骨小梁断裂少，表明运动训练后骨质改善。本实验结果表明骨密度和骨形态等指标在运动对骨重塑的干预中灵敏度低。目前分子标记在实时预测骨重塑上更占优势，机械应力下能反映骨吸收和骨形成的分子标记尚待研究。PBMC中wnt信号途径的基因Tnf、Jun、Mmp9、Cox2和Msx2的QRTPCR检测结果发现运动后24 h破骨细胞的活性减弱，骨重塑以骨形成为主，这与骨微结构变化相吻合，表明运动后PBMC中上述基因的表达变化与骨重塑变化相一致，提示上述基因可作为反映运动对骨重塑影响的候选分子标记。

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The Effect of Treadmill Running on Wnt Pathway Related Bone Remodeling Genes in Growing Rats

Yang Yongjie1，Gao Li1，Zhang Lan1，Chen Wan1，Li Xiangdong2，Chen Yan1，Wang Zhaohui1，Shen Dongying1

1 Shandong Institute of Physical Education and Sports，Ji’nan 250102，China
2 Qianfoshan Hospital of Shandong Province，Ji’nan 250102，China

Yang Yongjie，Email：yangyongjie@sdpei.edu.cn

ObjectiveTo explore the expression of the Wnt pathway related genes--Jun，Mmp9，Cox2，Tnf and Msx2 in peripheral blood monocytes（PBMC）in growing rats after treadmill training，so as to un⁃covertherelationship between thesegenesand boneremodeling.MethodsTwo-month-old male Sprague-Dawley（SD）rats were randomly divided into a control group（n=12）and an exercise group（n= 12）.The rats in the exercise group

50min treadmill running at 25 m/min，5 days per week for 12 weeks.Slope gradient of the treadmill was adjusted at 0°.At the end of experiment，the body weight，the muscle weight，the bone mineral content（BMC）and the bone mineral density（BMD）of all rats were evaluated in vivo using dual-energy x-ray absorptiometry（DEXA，XR-600）.All rats were sac⁃rificed in 24 hours after the final training.The BMD and the morphological change of the right femur were examined.And the bone microarchitecture in the distal femoral metaphysis was evaluated using a microcomputed tomography（micro-CT）system.PBMC was harvested，and the mRNA expression of Jun，Mmp9，Cox2，Tnf and Msx2 were detected using QRT-PCR.ResultsCompared with the control group，the body weight in vivo，bone surface/bone volume and trabecular bone pattern factor decreased signifi⁃cantly，whereas volume fraction and trabecular thickness increased significantly in the exercise group（P＜0.05）.No significant differences were observed in the trabecular number and trabecular separation be⁃tween the two groups，as were the BMC，BMD and muscle weight of rat as well as the BMD and the morphological change（length，thickness and width）of the femur.The results of trabecular microstructure in the distal femoral metaphysis showed that running exercises increased the trabecular number and re⁃duced the breakage of bony trabeculae.The treadmill training up-regulated the Msx2 mRNA transcrip⁃tion，down-regulated that of the Jun，Mmp9 and Cox-2，but had no effect on Tnf transcription.Conclu⁃sionsThe mRNA transcript alteration of the Wnt Pathway Related Genes Jun，Mmp9，Cox2，Tnf and Msx2 in PBMC matched the changes of bone remodeling caused by exercise very well，and these genes may serve as perfect molecular marker candidates for bone remodeling.

growing rat，treadmill，peripheral blood mononuclear cell，bone remodeling，Wnt

2016.06.24

山东省自然科学基金青年基金资助项目（ZR2013CQ034）；山东省自然科学基金资助项目（ZR2014CL017）

杨永杰，Email：yangyongjie@sdpei.edu.cn