有氧运动对C57BL/6小鼠骨骼肌肌浆网钙释放相关基因表达的影响

刘效磊 牛燕媚 袁海瑞 刘素娟 傅力2，

1天津体育学院健康与运动科学系（天津 300381） 2天津医科大学康复与运动医学系

运动可以引起机体产生一系列的适应性改变。单次运动引起机体组织细胞内多个信号通路的变化，并能持续数个小时。这些信号的变化最终导致基因表达谱的改变，而后基因表达逐渐恢复到运动前水平。而长期运动则可能来自于多次运动产生的叠加效应并稳定改变了特定基因的表达水平，进而最终引起机体某些功能的改变［1］。骨骼肌组织具有很高的可塑性，在环境因素、营养状况以及收缩活动等改变的刺激下其结构及功能可以发生适应性改变［2］，并且这些结构及功能的改变均以基因表达谱的变化为基础。基因芯片技术是20世纪90年代发展起来的前沿生物技术，在基因表达分析、基因突变与多态性分析、疾病诊断与治疗以及药物研发中有着广泛的应用，可同时以大规模、高通量的方式分析成千上万个基因在不同状态下的表达情况。目前已有大量研究利用基因芯片技术研究运动对机体骨骼肌基因表达的影响［3-5］，而运用基因芯片研究长期有氧运动引起的骨骼肌基因表达谱改变的报道尚不多见。本研究通过对安静对照组及6周有氧运动组C57BL/6小鼠骨骼肌基因芯片表达谱进行分析，筛选差异基因，发现长期有氧运动对骨骼肌钙信号通路，特别是肌浆网（sarcoplasmic reticulum，SR）钙释放相关基因的表达有较大影响，为研究长期有氧运动对骨骼肌SR钙循环的影响机制提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 动物模型的建立

选用20只C57BL/6小鼠（军事医学科学院实验动物中心提供），清洁级、雄性、4周龄，随机分为安静对照组（C）和有氧运动组（E）。小鼠体重约 14.8±0.39克，两组间无显著性差异。运动组采用有氧跑台运动，首次运动跑台坡度为0，速度为10米/分，隔天递增速度直至12米/分（强度相当于75%VO2max），适应性训练1周，之后连续进行，1 次/天，60 分/次，5 次/周，为期 6 周［6］。

1.2 取材及指标检测

分别称量两组动物实验前后体重。运动训练结束24小时后，两组动物禁食16小时，摘眼球取血留取小鼠血液样本，静置30分钟后，4℃，3000g/分钟离心15分钟，提取血清，置于－80℃保存备用。然后分离小鼠股四头肌，并迅速置于液氮中速冻，后保存于－80℃冰箱。每组随机选取4只小鼠骨骼肌标本进行基因芯片分析，分别标号为 C1、C2、C3、C6，E4、E6、E7、E8。并运用酶法测定血清甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白（HDL）含量，血清游离脂肪酸（FFAs）水平采用比色法测定。

1.3 RNA提取及基因芯片的制备

小鼠骨骼肌组织标本检测芯片采用北京博奥生物芯片有限公司32k Mouse Genome Array。总RNA的提取采用 Trizol（Invitrogen，Gaithersburg，MD，USA）一步法，通过异丙醇沉淀RNA，并采用NucleoSpin誖RNA clean-up试剂盒（MACHEREY-NAGEL，Germany）纯化总 RNA，最后用分光光度计定量，甲醛变性凝胶电泳观察RNA质量。

该芯片共有约32256条70bp长度的Oligo DNA，来自于 Operon公司的小鼠全基因组Oligo库http：//www.Operon.com。芯片的质量控制采用一段固定化的阳性对照序列及四个看家基因作为阳性对照，并在芯片上点有50%DMSO作为阴性对照。

1.4 芯片图像采集和数据分析

采用博奥公司LuxScan 10 KA双通道激光扫描仪扫描芯片。扫描结果采用LuxScan 3.0图像分析软件分析，并把图像信号转化为数字信号。然后运用Lowess方法对芯片数据进行归一化。将基因临界表达信号值定位800，删除荧光信号弱的基因以及芯片上的阴性对照、内标、外标等冗余的数据。然后用SAM软件（Significance Analysis of Microarrays Software）进行分析，错误检出率False Discovery Rate，FDR）控制在5%以内，再以 1.5倍标准筛选差异表达基因。对筛选得到的数据用Cluser 3.0软件进行层次聚类分析，表示各实验组数据的相似程度。运用博奥生物分子功能注释系统V4.0（Capital Bio Molecule Annotation System V4.0），并采用 KEGG京都基因和基因组百科全书）数据库对差异基因进行通路（Pathway）分析。

2 结果

2.1 体重变化及血液生化指标

图1显示。实验后两组小鼠体重无显著性差异。有氧运动组相对安静对照组血液TG、TC、FFA水平有下降趋势，但无统计学意义，而HDL水平则显著性上升（如表 1）。

表1 实验后两组小鼠血清TC、TG、HDL、FFA水平比较

2.2 RNA提取结果

各组RNA OD260/OD280均大于1.8，甲醛变性凝胶电泳显示28S和18S两条主带，两条主带的亮度28S∶18S 为 2∶1，符合实验要求（如图 2）。

2.3 基因表达谱及数据分析结果

运用SAM软件对安静组与运动组表达差异基因进行筛选，筛选条件FDR设定为5%以内，差异倍数（Fold Change）为1.5倍，得到两组动物差异表达基因共723个，其中表达上调基因510个，表达下调基因213个。用Cluster3.0软件对筛选的表达基因进行层次聚类分析（如图3），非监督层次聚类结果显示，8样本各自聚集，准确分为安静和运动两组。

2.4 差异基因的Pathway分析

运用博奥生物分子功能注释系统V4.0（CapitalBio Molecule Annotation System V4.0）并采用 KEGG数据库对差异基因进行Pathway分类（如表2）。其中钙信号通路有氧运动与对照组相比共有6个基因表达具有显著性差异，表达上调基因2个，分别为鸟嘌呤结合蛋白-α11（Phosphorylase Kinase alpha 11，Gna11）和血小板衍生生长因子 α （Platelet Derived Growth Factor Receptor α，Pdgfra），表达下调基因 4个，分别为磷酸化酶激酶 -α1（Phosphorylase Kinase α 1，Phka1）、磷脂酶 C-δ4（Phos pholipase C delta 4，Plcd4）、Ryanodine 受体 1（Ryanodine Receptor 1，RYR1）和肽酰脯氨酸异构酶D（Peptidylprolyl Isomerase D，Ppid）（如表 3）。

表2 安静对照组和有氧运动组差异表达基因KEGG数据库Pathway分类

续表2

续表2

续表2

表3 钙信号通路差异表达基因

3 讨论

有氧运动能够增强机体的糖、脂代谢能力，提高能量代谢相关细胞核因子活性以及机体组织对胰岛素的敏感性［7］，因而被广泛应用于肥胖、胰岛素抵抗（insulin resisance，IR）以及 2型糖尿病（type 2 diabetes，T2DM）等代谢性疾病的预防和临床治疗，但其具体的分子机制尚不完全明了。本实验中，经过6周有氧跑台运动，运动组小鼠血液TG、TC、FFA水平与对照组相比有下降趋势，但差异不显著，而HDL水平则显著上升（P<0.05），表明长期有氧运动对于脂代谢有明显改善作用。

目前已有大量研究运用基因芯片探索运动对机体基因表达谱的影响。Mahoney等人运用基因芯片研究单次有氧运动后基因表达谱的变化，差异表达基因涉及代谢及线粒体生物合成、氧化应激、离子跨膜转运等［3］。Schmutz等对比了6周有氧训练及对照组在单次有氧运动后股外侧肌基因表达情况，发现表达差异基因多为氧化代谢及糖酵解相关基因［5］。本研究结果显示，有氧运动组小鼠与对照组相比，共有36条代谢通路相关基因表达具有显著性差异（表1），提示有氧运动可以引起骨骼肌细胞代谢机能的适应性改变，而且目前利用基因芯片发现运动引起的差异表达基因多为代谢相关基因。通过分析本次实验芯片数据，发现长期有氧运动引起了Ca2+信号通路的适应性改变。有氧运动组与对照组相比，共有6个Ca2+信号通路（Calcium Signaling Pathway）基因表达具有显著性差异（Q value=5.34E-4，如表3），其中RYR1和Plcd4与骨骼肌SR Ca2+释放过程关系密切。SR是肌肉组织中调节细胞Ca2+浓度的重要结构。SR Ca2+摄取及释放对维持骨骼肌细胞结构和功能具有重要意义，与骨骼肌兴奋－收缩偶联密切相关，直接影响骨骼肌运动机能［8-10］。细胞内SR主要的Ca2+释放通道有两条，即RYRs敏感性通道和 1，4，5-三磷酸肌醇受体（IP3R）敏感性通道。RYR介导的胞内钙库释放Ca2+对维持胞内钙平衡起着重要作用。RYR以同源四聚体形式存在，有三种亚型，分别为RYR1、RYR2、RYR3，其中RYR1主要在骨骼肌细胞表达。本实验结果表明，长期有氧运动使C57BL/6小鼠骨骼肌RYR1表达显著降低（Fold Change=0.07，如表3）。

单次急性运动可以使SR Ca2+摄取及释放水平明显降低而引起骨骼肌疲劳。Matsunaga等研究表明，大鼠单次高强度跑台运动（100%VO2max）可导致 SR Ca2+摄取及释放水平分别降低 24%和22%［11］。Stavrianeas等研究发现，单次中等强度长时间跑台运动（Mean=81min）使腓肠肌 SR Ca2+摄取及释放水平分别降低 37%和 28%［12］。而目前长期有氧运动对SR Ca2+循环影响的报道尚不多见。Li等分别测试了对照组、耐力运动训练组和抗阻运动训练组安静状态下股四头肌SR Ca2+释放水平，结果表明，耐力运动训练组SR Ca2+释放水平显著低于安静组和抗阻运动组（P<0.05）［13］。造成长期耐力运动训练后SR Ca2+释放水平降低的机制尚不明确，其可能的原因是耐力训练导致骨骼肌中Ⅱ型肌纤维比例降低。研究表明，相对于Ⅰ型肌纤维细胞，Ⅱ型肌纤维细胞具有更高的RYR浓度，并且Ⅱ型肌纤维Ca2+释放能力是Ⅰ型肌纤维的2倍，而Ca2+摄取能力及Ca2+ATPase活性则是Ⅰ型肌纤维的2～3倍［13］。长期耐力训练使骨骼肌中Ⅱ型肌纤维比例降低，Ⅰ型肌纤维比例升高，从而整体上降低了骨骼肌基础状态下SR Ca2+释放水平。本实验中，RYR1表达水平显著降低也从侧面证明了这一假设。另外，该研究还分别测试了对照组、耐力运动训练组和抗阻运动训练组在进行50次最大等张收缩（180°/s，0.5Hz）后股四头肌Ca2+的释放水平，结果表明，三组Ca2+释放水平分别降低 42.1±3.8%、31.3±6.1%、43.4±3.9%，耐力运动训练组Ca2+释放下降水平显著低于安静组和抗阻运动训练组（P<0.05），表明有氧运动训练可以提高骨骼肌运动及抗疲劳能力。长期的有氧运动使骨骼肌单次运动后SRCa2+释放下降水平显著降低，推测长期有氧运动后RYR1表达水平改变可能具有骨骼肌类型特异性，即长期有氧运动训练可能通过提高骨骼肌Ⅰ型肌纤维细胞RYR1的表达水平改善SR Ca2+循环，提高骨骼肌运动及抗疲劳能力。另外，关于长期有氧运动对Ca2+循环及RYR1表达的影响，仍存在着不同的研究结果。Matsunaga等的研究发现，8周有氧运动训练可以引起大鼠股外肌浅区肌肉SR Ca2+摄取提高12.4%，而Ca2+-ATPase活性及Ca2+释放则没有明显变化［14］。另有研究报道，有氧训练显著提高了骨骼肌RYR1的表达水平［15，16］。造成这种差异的可能原因是不同的运动方式及所取肌肉组织，因而对于这一问题，仍需要进一步深入研究。

目前，一般认为运动影响SR Ca2+释放的机制包括：细胞外K+聚集导致动作电位减弱；运动导致细胞内ATP浓度降低，Mg2+浓度升高抑制了SR Ca2+释放通道的开启；运动后磷酸肌酸降解产生的无机磷进入SR与Ca2+形成沉淀，导致SR游离Ca2+浓度降低等［10］。而通过改变骨骼肌各类型肌肉RYR1的表达而影响SR Ca2+的释放则未见报道，因而RYR1可以作为长期有氧运动引起骨骼肌运动机能改变以及骨骼肌疲劳机制研究的重要靶点。

SR的另一条Ca2+释放通道即 IP3R通道。1，4，5-三磷酸肌醇（IP3）作为第二信使是IP3Rs的主要兴奋剂，可以直接诱导Ca2+的释放。外界刺激信号作用Ca2+释放通道于细胞膜相应受体，通过膜上的磷脂酶C（Phospholipase C，PLC）催化磷脂酰肌醇 4，5-二磷酸（PIP2）水解产生IP3和甘油二酯（DAG），其中水溶性小分子物质IP3由细胞膜扩散至细胞质后与IP3R结合，引起Ca2+释放通道开放［17］。可见PLC在激活IP3R Ca2+释放通道中发挥着重要作用。到目前为止，在哺乳动物中已鉴定出的PLCs同工酶共有15种，按其氨基酸序列及活化机制的不同可以将其分为 6 类，即 PLCβ、PLCγ、PLCδ、PLCε、PLCζ及PLCη，其中 PLCδ又分为 1～4四个亚型，目前研究较为透彻的为PLCδ1，而PLCδ4（Plcd4）则研究较少。一般认为，Plcd4在精卵融合、促进细胞生长及调节细胞PIP2水平方面发挥重要作用，并且溶血磷脂酸（lysophosphatidic，LPA）、缓激肽（bradykinin）以及血小板衍生生长因子（platelet-derived growth factor，PDGF）、胰岛素样生长因子（insulin-like growth factor，IGF-I）等都可以促进Plcd4的表达。Fukami研究认为，生长因子通过提高胞浆内Ca2+浓度而促进Plcd4的表达［18］。而对Hela细胞给予钙离子螯合剂BAPTA或EGTA后，LPA等对Plcd4的促进表达作用受到显著抑制［18］。因而，胞浆Ca2+浓度与Plcd4表达水平密切相关并且胞浆Ca2+浓度的不足可能会影响Plcd4的表达。芯片结果表明，有氧运动组与安静对照组相比，Plcd4表达量显著性下降（Fold Change=0.11，如表3）。而本实验由于没有测定小鼠骨骼肌细胞内Ca2+水平，因而无法得到长期有氧运动通过改变胞浆Ca2+浓度引起Plcd4表达水平改变的结论。但是Plcd4在PIP2水解及IP3R Ca2+释放通道开放过程中发挥重要作用，而细胞内游离Ca2+浓度与Plcd4表达水平密切相关，这为我们提供了一个新的视角，即从Plcd4角度研究长期有氧运动对SR Ca2+释放的影响，而相关研究尚属空白，有待于进一步研究。

6周有氧运动后，小鼠骨骼肌RYR1、Plcd4表达显著下降，并与骨骼肌SR Ca2+释放过程关系密切，因而可能是长期有氧运动影响C57BL/6小鼠骨骼肌SR钙释放的重要介质分子。目前运动对骨骼肌SR Ca2+转运的研究多集中于单次急性运动，而长期运动对其影响的研究尚不系统，有待于进一步深入研究。骨骼肌收缩是运动实现的必要条件，而SR Ca2+循环与骨骼肌运动机能密切相关，并直接影响肌肉收缩速度与力量，因而深入研究SR Ca2+摄取与释放的机制，对于正确认识运动对机体的影响规律，消除疲劳，提高骨骼肌运动能力具有重要意义。

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