不同运动时间对2型糖尿病大鼠骨骼肌IRS-2蛋白含量及磷酸化的影响

华宏 王耀光 郭仁勇

1辽宁师范大学体育学院（大连 116029） 2辽宁师范大学生命科学学院

胰岛素受体底物-2（insulin receptorsubstrate，IRS-2）是细胞质中的接头蛋白（Adaptor），主要连接胰岛素受体（IR）和多种效应分子，从而介导细胞对胰岛素（INS）等的反应［1］。随着基因剔除技术的发展，发现剔除IRS-2基因的纯合子动物（IRS-2-/-）具有 2型糖尿病（DM）的全部特征［2］，因此IRS-2及活动规律成为近来2型DM研究的热点。运动是治疗2型糖尿病的主要非药物手段，运动可提高胰岛素的敏感性和作用效果，由于IRS-2的特殊作用，运动对胰岛素的影响与IRS-2的介导功能相关。有研究发现运动可提高IRS-2蛋白表达和磷酸化程度［3，4］，但不同运动时间对 IRS-2含量和磷酸化的影响还不清楚。故本实验通过测定2型糖尿病大鼠进行8周不同运动时间的跑台运动后骨骼肌IRS-2蛋白含量及磷酸化变化，为DM运动疗法提供更科学的理论指导。

1 材料与方法

1.1 动物

70只健康 Sprague-Dawley（SD）大鼠，体重（200±16）g，雌雄不拘，由大连医科大学动物中心提供（许可证号：SCXK（辽）2004-0017）。在标准环境下常规分笼喂养，自由饮水进食。适应性喂养1周后进行适应性训练。随机选择10只大鼠为正常对照组，其余为实验组，制备2型糖尿病大鼠模型。

1.2 实验方法

1.2.1 2型糖尿病大鼠模型制备

参照洪丽莉等的方法制备模型［5］。实验组大鼠进行4周高脂饲料喂养，同时加3%果糖饮水。4周后按30mg/kg体重的剂量一次性腹腔内注射STZ（溶于0.1 mmol/L柠檬酸缓冲液，pH4.4）。注射后1周进行葡萄糖耐量试验。方法为：大鼠禁食4～6小时，经腹腔注射葡萄糖（2g/kg体重），断尾采血测定0、60和120min时的血糖。DM诊断标准为连续2次空腹血糖（FGB）≥7.8mmol/L或葡萄糖负荷后2h血糖≥11.1mmol/L［6］。此方法造模成功率达85%。2周后，大鼠禁食12h后，断尾取血，用罗氏试纸测大鼠空腹血糖（FBG），同时检测空腹胰岛素（FINS）。

高热量饲料配方：100kg大鼠基础饲料中加人全蛋粉6kg（大连生化制品有限公司生产）、蔗糖23kg（广西糖业集团销售有限公司生产）、炼猪油26.5kg（河北石家庄制造），混和成形，烤干成150kg。其总热量为20.083J/g，即4.80CaUg，其中蛋白质占15%，碳水化合物占51%，脂肪占25%。

1.2.2 糖尿病大鼠运动方案

将符合标准的50只糖尿病大鼠随机分为糖尿病对照组和糖尿病运动组（20min组、40min组、60min组和80min组），并继续高脂饲料喂养。各糖尿病运动组运动强度参照 Soya等的实验［7］，以20m/min进行8周跑台运动。运动时间分别为每天20min、40min、60min和80min。对照组常规饲养。本实验动物的处置符合国际实验动物伦理学要求。

1.2.3 取材和指标测定

各组大鼠运动后即刻腹腔内注射3%戊巴比妥钠50mg/kg体重）麻醉，取后肢股四头肌肉组织，置于液氮中，待提取蛋白质。

称取骨骼肌100mg，剪碎后置于组织匀浆液600μl 2%SDS，50mmol/L Tris-HCl，pH6.8，10%甘油，1mmol/L Na3VO4，1mmol/L PMSF，5g/L Leupeptin）中，采用 Poly ron PT10-35组织扩散仪制备组织匀浆（7000～10000g）。所得匀浆置于4℃、10000g离心10min，取上清液，采用改良Lowery法测定蛋白浓度［8］，以备上样。

1.2.4 IRS-2蛋白表达测定

采用Western blot免疫印迹法。取含等量总蛋白50μg）的样品，经7.5%SDS-PAGE分离，电转膜后以 5%脱脂奶粉封闭，再分别与兔抗人IRS-1和IRS-2多克隆抗体反应，继而与辣根过氧化酶标记的羊抗兔二抗作用，以增强化学发光法（ECL）显示蛋白条带，并用激光光密度扫描仪测定蛋白条带光密度。

1.2.5 IRS-2蛋白磷酸化的测定

采用免疫沉淀及增强化学发光法。取含等量总蛋白500μg）的样品，与抗IRS-2抗体4℃孵育过夜。抗原－抗体复合物经固相化蛋白G沉淀后，重新溶解于Laemmli上样缓冲液，加热到95℃ 5min，经7.5%聚丙烯酰氨凝胶电泳1.5h。抗－磷酸化酪氨酸免疫印迹，醋酸纤维薄膜直接与辣根过氧化物酶结合的一抗APY20H孵育1.5h。充分洗涤后与ECL反应1min，即刻X线片曝光，洗片后用Leica Q550-IW图像分析仪（德国）进行扫描，计算光密度。

以正常对照组的IRS-2蛋白含量和磷酸化为100作为标准，计算其他各组的相对量。

1.2.6 试剂与仪器

IRS-2多克隆抗体够自R&D Systems公司，ECL购自英国Amersham公司。预染蛋白Marker购自New England BioLabs。血糖（FBG）用快速血糖仪检测，仪器及试纸由美国强生公司生产。胰岛素（FINS）用放射免疫法检测，试剂盒由南京生物工程研究所提供，批内CV<3%，批间CV<5%。甘油三酯（TG）试剂盒：北京福瑞生物工程公司生产，批号：040702。总胆固醇（Tc）试剂盒：北京福瑞生物工程公司生产，批号：040702。动物跑台由北京硕林苑科技有限公司生产，型号为SLY-RTML六跑道大鼠跑台。

1.3 统计学分析

采用SPSS11.0软件包对实验数据进行统计处理，以均数±标准差表示，组间显著性差异比较采用单因素方差分析（ONE-WAY ANOVA），多重比较采用LSD法。显著性水平α为0.05。

2 结果

表1显示，与正常对照组相比，糖尿病大鼠体重明显增加（P<0.01），血清甘油三酯和总胆固醇水平也明显升高（P<0.01），同时血糖和胰岛素水平明显升高P<0.01）。

表1 造模成功后两组大鼠体重、血糖、血脂和胰岛素水平

表2显示，与对照组相比，糖尿病对照组股四头肌IRS-2蛋白含量下降41%（P<0.01）。与糖尿病对照组相比，运动20min组、40mmin组、60min组和80min组分别升高 11.7%、12.4%、12.2%和 11.9%（P<0.01）。与 20min组及80min组相比，40min组IRS-2蛋白含量分别升高10.9%和10.7%（P<0.05）。但各组仍未恢复到正常对照组水平。

与对照组相比，糖尿病对照组股四头肌 IRS-2磷酸化水平下降49%（P<0.01）。与糖尿病对照组相比，运动20min组、40mmin组、60min组和 80min组分别升高 11.2%、12.7%、12.2%和 11%（P<0.05和 P<0.01）。与 20min组和80min组比，40min组和60min组分别升高11.3%、11.5%（P<0.01）和 10.9%、11.1%（P<0.05）。但各组仍没有恢复到正常对照组水平。

表2 各组大鼠股四头肌IRS-2蛋白含量及磷酸化比较

3 讨论

根据Soya对运动强度的确定依据，20m/min相当于LT（乳酸阈）强度，LT为有氧代谢向无氧代谢的转折点，相当于4mmol/L血乳酸浓度，当运动强度高于LT时，机体的代谢开始转向无氧代谢。LT已经成为有氧健身锻炼和康复训练的一个强度标准。美国运动医学会（ACSM）和美国糖尿病协会（ADA）运动锻炼方案：运动与糖尿病专业指南［9］也将LT强度列为糖尿病康复锻炼推荐的上限强度。IRS-2主要连接胰岛素受体（IR）和多种效应分子［10］。INS与IR结合后，IR的 β 亚基近膜区酪氨酸（Tyr）自身磷酸化并且与IRS-2结合，IR上激活的酪氨酸蛋白激酶（PTK，IR-TK）催化 IRS-2上多个 Tyr磷酸化，为下游含SH2区的蛋白提供位点，形成信号蛋白复合物，以介导进一步的信号传导［11，12］。Park等的研究发现，运动可提高IRS-2蛋白含量和磷酸化程度［13－15］，但这些实验均采用单一固定时间，不同运动时间对IRS-2蛋白含量和磷酸化影响的研究还未见报道。本实验结果显示，8周运动后，与糖尿病对照组相比，运动组大鼠骨骼肌IRS-2蛋白含量显著增加，不同运动时间效果不同，并且IRS-2磷酸化的作用效果也存在差异，以运动40min效果最好。由于此类研究才刚开始，还需进一步探索。

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