采用LC-MS/MS检测人尿中睾内脂方法研究

陆江海 秦旸 杨树民 徐友宣 吴侔天

国家体育总局反兴奋剂中心（北京 100029）

睾内脂（testolactone，结构见图1）是一种阻止睾酮转化为雌二醇和雄烯二酮转化为雌酮的芳香酶抑制剂，临床上用于治疗男性不育等疾病［1］。睾内脂同时也被国际反兴奋剂机构（WADA）列为禁用药物［2］，对于它的检测国外文献主要采取HPLC法［3］，本研究首次采用LC-MS/MS法检测人尿中的睾内脂，现报告如下。

1 实验方法

1.1 仪器、试药

AgilentTechnologies6410 Triple Quad LC/MS；MettlerToledo电子天平；Sample concentrator（Bibby Scientific）；低速离心机（北京雷勃尔离心机有限公司）；低温恒温液浴循环两用槽（杭州雪中炭恒温技术有限公司）；Millipore超纯水机。

睾内脂和内标甲睾（来源：德国科隆兴奋剂检测实验室）；磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、碳酸钾、碳酸氢钠（AR，国药集团化学试剂有限公司）；β-葡萄糖醛酸苷酶（Sigma公司）；叔丁基甲醚、乙腈、甲酸、甲酸铵（Dima公司）。

1.2 试验条件

1.2.1 色谱条件

色谱柱：AgilentZorbax XDB-C18柱（2.1×50mm,3.5μm）；流动相采用pH3.5甲酸铵缓冲液（A）和乙腈（B）进行梯度洗脱；淋洗梯度：0分钟A90%，B10%，7分钟A10%，B90%。流速：0.5毫升/分钟，运行时间7分钟，平衡时间3分钟；进样量10μl；柱温40℃。

1.2.2 质谱条件

离子检测方式为多反应离子检测（MRM）（见图2）；离子极性为正离子（positive）；离子化方式为电喷雾离子化（ESI）；毛细管电压为 4000伏（V）；干燥气温度：330℃；干燥气流速：10.0升/分钟，雾化气压力：35psi，碰撞电压（Fragmentor）：100伏（V）；用于定量的离子对为 m/z 301→121，碰撞能量（Collision Energy，CE）：45 伏（V）；用于定性的离子对为m/z 301→225，碰撞能量：20电子伏特（eV）。

1.3 溶液配制

称取睾内脂对照品0.73mg，配制成1mg/ml储备液。该储备液用超纯水稀释成系列对照品供分析用。

称取内标甲睾1.23mg，配制成1mg/ml储备液。该储备液用甲醇稀释成10μg/ml内标溶液供分析用。

1.4 样品前处理

在 2ml尿样中加入内标 20μl，0.2M 中性磷酸缓冲液 1ml，β-葡萄糖醛酸苷酶 50μl，混匀后 55℃温浴 1小时后，加入0.5ml pH10的碳酸氢钠缓冲液、4ml叔丁基甲醚，振荡10分钟，离心5分钟，－30℃冷冻分离，取上层有机相。55℃氮气吹干，将残留物溶解在500μl流动相中，进样 10μl于 LC-MS/MS。

2 结果与分析

2.1 方法专属性

在上述条件下，睾内脂保留时间为4.4分钟，内标保留时间为5.4分钟。结果表明：人尿中杂质不干扰样品和内标的测定，基线噪音小，在此条件下测得的结果能代表原药的浓度，见图3，4。

2.2 人尿中药物标准曲线

取适量睾内脂对照液用氮气吹干，加入空白人尿2ml，使人尿中的睾内脂浓度的增加为 0.1μg、0.5μg、2μg、5μg、10μg、25μg、50μg/ml，按“1.4”项操作，以睾内脂浓度的增加值X（μg/ml）为横坐标，睾内脂和内标峰面积的比值Y为纵坐标，得回归方程：Y=0.2336X+0.6137，r=0.9984，睾内脂线性范围为0.1～50μg/ml，定量下限为0.1μg/ml，S/N>10。

2.3 精密度试验

取空白尿 2ml，按“1.4”项操作，使人尿中的睾内脂浓度增加值分别为 0.1μg、1μg、10μg/ml，每个浓度取 6份样本（n=6+6+6）进行分析，连续测定3天，随行标准曲线，以当日的标准曲线计算每个样本的浓度。得到日内和日间RSD，低、中、高3种浓度的日内和日间RSD分别为7.84%、5.81%、1.51%和 5.70%、5.36%、1.67%。结果表明，精密度符合常规检测要求。

2.4 提取回收率

取空白尿 2ml，按“1.4”项操作，但 20μl内标和0.2μg、2μg、20μg 睾内脂分别在 55℃氮气吹干前加入，进样分析。计算睾内脂和内标的峰面积比值（fs）。

取空白尿2ml，按“1.4”项操作，使人尿中的睾内脂浓度增加值分别为 0.1μg、1μg、10μg/ml, 进样分析。得到睾内脂和内标的峰面积比值（fx），提取回收率（R）按 R=fx/fs×100%计算，低、中、高3种浓度的提取回收率分别为 56.2%、68.1%、66.6%；RSD 分别为 3.81%、4.70%、7.23%。

2.5 最低检测下限

取适量睾内脂对照液用氮气吹干，加入空白人尿2ml，使人尿中的睾内脂浓度的增加为 0.5ng、1ng、2ng、5ng、10ng、25ng/ml，按“1.4”项操作，测得最低检测下限为 1ng/ml，S/N=3。

3 总结

睾内脂是国际反兴奋剂机构（WADA）禁用药物清单上的药物，关于它的文献很少，仅有一篇HPLC法检测的文章。本文首次对采用LC-MS/MS方法检测睾内脂进行研究，所选用的两对离子对（301→121、301→225）具有高灵敏度和强专属性的特点，国际反兴奋剂机构对睾内脂的最低检测能力要求是10ng/ml，本方法可以做到检测1ng/ml的样品，且分析时间短（分析时间+柱平衡时间为10分钟），对睾内脂的常规检测有很大的帮助，取得了较为满意的结果。

［1］RamanJ，SchlegelPN.Aromatase inhibitors for male infertility.J Urol，2002，167：624-629.

［2］http://www.wada-ama.org/en/prohibitedlist.ch2.

［3］PascucciVL，YeagerRL，SherinsRJ.Quantitation of testolactone and 4,5-dihydrotestolaction in plasma and urine using high-performance liquid chromatography.J Chromatogr，1983，14：79-85.