机械牵拉诱导骨骼肌卫星细胞激活的分子机制研究进展

陈涛 王海燕 陈彩珍 卢健

青少年健康评价与运动干预教育部重点实验室，华东师范大学体育与健康学院（上海 200241）

了解卫星细胞激活过程中的控制因素，有利于设计出更好的促进骨骼肌发育和修复方案，以应用到运动科学（提高运动员机能表现）和健康科学（特别是肌肉萎缩和Sarcopenia的治疗方法）领域。

1 骨骼肌卫星细胞的激活

卫星细胞的激活是提供新的肌细胞核（融合成新的肌纤维或当前肌纤维肥大）的第一步，骨骼肌发育、损伤修复的过程中同样需要卫星细胞的激活。在成体骨骼肌中，处于静息状态的卫星细胞只在适当的条件（损伤、运动刺激、牵拉或去神经）下被激活（进入细胞周期）［1］。激活的卫星细胞移位到损伤位点，进行DNA复制，增殖、分化融合到肌纤维上或形成新的肌纤维，通过这种途径，肌细胞核增加，也为骨骼肌肥大奠定基础。

卫星细胞的激活过程伴随着复杂的生物学调节机制，卫星细胞的活化、增殖和成肌分化是由细胞连接、细胞与细胞外间质的相互作用及生长因子决定的，如胰岛素样生长因子1（IGF-1）、成纤维细胞生长因子（GFF）、肝细胞生长因子（HGF）、一氧化氮（NO）在肌卫星细胞激活中的信号作用已被很多研究证实［2］。

目前国内学者多采用体外细胞培养技术研究卫星细胞的增殖和分化能力，已取得显著成果。例如，路睿睿等［3］采用脂多糖刺激体外培养的骨骼肌卫星细胞，观察肌卫星细胞产生肝细胞生长因子及肌卫星细胞增殖分化的变化，发现脂多糖可诱导肌卫星细胞自分泌肝细胞生长因子，并促进肌卫星细胞增殖分化。邵素霞等［4］研究发现肝细胞生长因子对骨骼肌卫星细胞具有较强的促增殖作用。

国外学者则多从分子水平的信号转导通路入手，研究HGF等生长因子对肌卫星细胞的生物学调节机制。NO-HGF-c-met通路被认为是卫星细胞激活过程中非常重要的一条信号通路，因为在众多的生长因子中，HGF是唯一一个能把安静状态下的卫星细胞激活并促进其进入细胞周期的生长因子［5，6］。

2 骨骼肌卫星细胞激活过程中的关键因子

2.1 HGF

HGF因对肝细胞具有很强的丝裂原作用而被命名为肝细胞生长因子［7］。1987年，Stoker等［8］发现成纤维细胞分泌一种能促进上皮细胞集落扩散的细胞因子，称为离散因子（SF），后来研究发现SF即HGF［9］，随着研究的深入，发现HGF/SF作为一种多效能的细胞因子，在许多细胞和组织中发挥促细胞发育和分化的作用。HGF/SF的信号作用是由原癌基因c-met编码的跨膜受体蛋白所介导的［10］。Jennische［11］等在再生的骨骼肌中检测到 HGF mRNA，第一个将HGF与骨骼肌联系起来。而后Tatsumi等［5］在安静和激活状态下的骨骼肌卫星细胞膜上均发现了HGF及其受体c-met。转基因小鼠过度表达HGF会导致骨骼肌异位发育，提示HGF在骨骼肌发育的过程中具有生理上的分散作用［12］。此外，Bladt等发现c-met突变小鼠不能形成正常的骨骼肌群［13］。1995年Allen等发现HGF激活大鼠离体骨骼肌卫星细胞，促使其进入细胞周期［6］。1998年Tatsumi也证实在大鼠骨骼肌中，HGF通过其受体c-met能激活卫星细胞［5］。此后一系列包括对培养离体肌原细胞、单根肌纤维及活体骨骼肌的研究均证实HGF通过与卫星细胞膜上的c-met结合激活卫星细胞［14，15］。一般情况下，HGF位于肌细胞外区域，有可能与细胞外基质主要组成部分——蛋白聚糖连接在一起，当骨骼肌损伤时，HGF能快速从细胞外基质释放出来并与卫星细胞膜上的 c-met结合，激活卫星细胞［5，16］。

2.2 NO

内源性NO是在一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）和还原型尼克酰胺嘌呤二核苷酸（ANPDH）的共同作用下，利用L-Arg和活性分子氧生成的。NOS在多种细胞中均有表达，目前已确定有3种NOS同工酶，分别是神经原型（neuronal-NOS，nNOS）、内皮型（endothelial-NOS，eNOS）和诱导型（inducible-NOS，iNOS）［17］。骨骼肌中主要表达nNOS，Ⅰ型和Ⅱ型肌纤维中均有nNOS表达，nNOS通过与抗肌萎缩蛋白-糖蛋白复合体结合分布在骨骼肌细胞膜上［18］。正常情况下，骨骼肌中的NO处于非常低的水平，卫星细胞也处于安静状态，在运动训练、负重、损伤、剪切应力或机械牵拉的刺激下，NOS的表达或活性增加［19］。2000 年 Anderson［15］研究证实挤压损伤的骨骼肌中，NO的快速释放是诱导卫星细胞肥大并脱离其毗邻卫星细胞的关键。2002年Anderson等［16］又通过离体培养单根肌纤维发现，NO可以激活安静状态下的卫星细胞，阻断NO的合成，也阻断了卫星细胞的激活。

3 机械牵拉刺激骨骼肌卫星细胞激活的信号通路

3.1 HGF与骨骼肌卫星细胞激活

Tatsumi等［20］采用细胞培养技术，利用真空负压牵拉刺激，从9月龄SD大鼠骨骼肌中分离出安静状态下的卫星细胞，牵拉刺激12、24、48小时后发现，激活状态的卫星细胞数量显著增加，与HGF激活离体大鼠骨骼肌卫星细胞的情况一致［20，21］，使用HGF阻滞剂可以降低机械牵拉诱导的卫星细胞激活的数量。其后发现2小时的牵拉即可诱导卫星细胞的激活，且抑制HGF的活性，发现卫星细胞的激活数量明显减少，几乎与对照组无差异。对牵拉2小时组培养基进行免疫印迹检测，发现具有活性的HGF，并且其能够激活未牵拉组卫星细胞。为了确定HGF的来源及HGF是否定位在c-met呈阳性的卫星细胞上，Tatsumi［20］等又使用了免疫荧光双标记技术，结果证实HGF主要集中在细胞膜表面。使用1.0M浓度的NaCl洗涤牵拉12小时组的卫星细胞以去除细胞外的HGF，牵拉诱导的激活作用消失，继续牵拉刺激该组发现，卫星细胞依然可被内源性的HGF激活。这些研究为牵拉刺激诱导的卫星细胞激活作用是通过细胞外基质HGF释放实现的提供了有力的证据。

3.2 NO与骨骼肌卫星细胞激活

为了研究NO在HGF释放过程中的作用，Tatsumi等［21，22］通过添加NOS抑制剂 （L-NAME），发现牵拉刺激卫星细胞的激活作用消失，增加HGF可以使这种激活作用得到恢复，说明L-NAME并非直接抑制卫星细胞的激活，而是通过抑制HGF从而抑制卫星细胞的激活。用免疫印迹法检测该组培养基，发现HGF并未释放出来。此外，给非牵拉组添加亚硝基五氰络铁酸钠二水化合物（一种NO供体），发现卫星细胞激活的速度增加，用免疫印迹法检测培养基，也能检测出HGF。这些结果表明，机械牵拉作用诱导的HGF从其细胞外基质储存库中的释放依赖NO的生成［22］。

3.3 MMP与骨骼肌卫星细胞激活

2006年，Yamada等［23］发现基质金属酶蛋白（MMPs）介导了NO诱导的HGF释放。MMPs的活性受到抑制的情况下，可阻断HGF的释放和后继的卫星细胞的激活。MMPs是一个锌依赖的肽链内切酶大家族，目前已明确其有25个家族成员，均有一个前肽区和一个包含锌离子的催化区域。作为肽链内切酶，其家族成员可以降解数种细胞外基质蛋白，如胶原蛋白、弹力蛋白、纤维结合蛋白、蛋白聚糖等［24］。MMP-2、3、7和9在骨骼肌中均有表达［25，26］，其中 MMP2、3、9 可以裂解硫酸类肝素蛋白多糖的核心蛋白，这些金属蛋白酶可能通过调节细胞外基质的完整和组成，在骨骼肌发育和修复过程中发挥重要作用［25］。NO可直接亚硝基化MMP，调节其活性。此外，有相关研究发现，NO可上调MMP-2和MMP-9的蛋白表达水平和酶活性。2008年，Yamada等［26］在对离体培养的大鼠骨骼肌卫星细胞施以30μM亚硝基铁氰化钠（一种NO供体）或机械牵拉2小时的过程中，发现非活性的MMP-2前体（72 kDa）转变成了成熟体（52 kDa），在加入NOS抑制剂L-NAME 10μM后，这种转变同样被抑制。在非牵拉组中，添加1μMNOC-7（可以自发生成NO），发现重组的MMP-2蛋白转化为成熟体MMP-2（52 kDa），免疫印迹检测该组培养基发现HGF。因此可以推测NO激活的MMP2也许介导了HGF从细胞外基质中的释放，从而激活卫星细胞。

2009年，Tatsumi［27］等发现钙 -钙调蛋白同样可以诱导HGF的释放并激活卫星细胞，并且可能在NO合成过程中起到一种信号作用。在体外培养的卫星细胞培养基中添加钙离子载体，2小时后HGF释放并激活卫星细胞，这种效果与机械牵拉或添加NO供体一样。添加钙调蛋白抑制剂可以消除这种激活作用。该研究结果提示，可能是钙-钙调蛋白通过激活NO的合成介导了细胞外基质释放HGF，从而激活卫星细胞。

综合以上一系列研究，可将NO依赖的卫星细胞激活信号通路归纳如下，即卫星细胞激活的分子机制是一系列分子级联应答反应的结果，包括钙-钙调蛋白的形成、NOS的激活、NO的生成、MMP的激活、HGF的释放、HGF与其受体c-met的结合等。

4 总结

卫星细胞是出生后骨骼肌中固有的、具有增殖分化潜能的肌源性干细胞，大部分处于静息状态。当骨骼肌受到损伤、运动刺激或机械牵拉时，卫星细胞被激活，进而增殖、分化，融合到临近的肌纤维上，以促进受损肌纤维修复再生或运动诱导的骨骼肌肥大。目前的研究结果表明，机械刺激触发的一系列级联反应需要NO-MMP2-HGF-c-met的参与，这可能就是骨骼肌将机械变化转化为化学信号从而激活卫星细胞的分子机制。当然，调节卫星细胞机能的信号通路还有很多，错综复杂，因此需要对“机械-生物学”在骨骼肌卫星细胞激活过程中的作用和机制进行深入研究和理解。

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