中国北方汉族男子FECH基因IVS3-48T/C多态与有氧运动能力表型指标的关联性研究

许亚丽 胡扬 温辉 任志军

1 河南大学体育学院（开封 475000） 2 北京体育大学科学研究中心3 河南省洛阳市中心医院神经外科 4 广东省江门市人民医院脑血管疾病科

血红素是人体内具有重要功能蛋白质如血红蛋白、肌红蛋白、线粒体细胞色素、过氧化物酶、鸟苷酸环化酶、细胞色素P450酶等的辅基，在运输和储备氧气、电子传递及能量生成、抗氧化、细胞信号转导及药物代谢等方面发挥重要功能。此外，血红素还参与珠蛋白mRNA转录和翻译以及红系分化的调节等［1-4］。如果体内血红素合成受限或缺乏，会导致贫血和白血病，还引起线粒体功能衰退、能量产生障碍和氧化应激增强等变化［5］。因此，血红素代谢与机体运动能力尤其是耐力密切相关。

亚铁螯合酶（ferrochelatase，FECH）是生物体中合成血红素的最后一个酶，催化亚铁离子嵌入原卟啉Ⅸ形成血红素，主要存在于骨髓、肝脏、血液的网状细胞和成纤维细胞中.如果FECH缺乏或功能受损，会导致原卟啉在红细胞内、肝内大量蓄积引发红细胞肝性卟啉病，对机体造成极大损害［6-8］。因此，FECH活性与有氧运动能力密切相关。目前，FECH基因多态性与运动能力的关联性研究国内外未见报道。本研究选取位于第3内含子中的IVS3-48T/C多态作为标记，观察该多态性与VO2max、通气无氧阈（VT）、跑节省化（RE）等指标初始值和耐力训练敏感性的关联，探寻预测有氧运动能力的分子遗传学标记。

1 对象和方法

1.1 研究对象

选取102名中国北方（东北三省、河北、山东等淮河以北平原地区）汉族健康男性受试者，年龄（18.82±0.88）岁，身高（171.67±5.83）cm，体重（60.27±6.54）kg。均为中国武装警察某部队的新兵（2003年1月入伍，3月参加实验），且其双亲、祖辈双亲均为汉族，入伍前均无系统运动训练史，体检合格。实验取得了所有受试者的知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 有氧耐力训练方案

受试者进行18周、每周3次的5000 m匀速跑训练。正式训练前先进行2周适应性训练。第3周开始进行每周3次5000 m匀速跑，训练强度控制为95%个体通气无氧阈时的心率±3次/min。从第12周开始以105%个体通气无氧阈时的心率±3次/min的强度运动。心率控制由芬兰Polar心率表实施。如因气候和军事行动等原因而被迫停训，则择日补训。参加训练的士兵作息时间一致，饮食条件一致，训练安排一致。同时，参加训练的士兵不再进行额外的2000 m以上的长跑训练，只进行一般军事和力量训练。

1.2.2 VO2max、VT、跑节省化的测定

VO2max、通气阈（Ventilatory threshold，VT）、跑节省化采用联合测试方法，在跑台（坡度为0）上逐级递增运动负荷测定。18周训练前后各测定1次，使用德国产固定跑台ERICH JAEGER Treadmill E6、德国产气体代谢分析仪JAEGER oxygen analyer和德国产心电监测仪HELLLGE SMS-181进行测量。

跑节省化实验参照Krahenbuhl的负荷标准，选取12.0 km/h（33.3 m/s）作为“适宜的极限下负荷速度”［9］。获取数据为摄氧量绝对值（VO2）、摄氧量相对值（rVO2），心率（HR），通气阈（VT），每分钟肺通气量（VE），跑节省化状态下的摄氧量绝对值（RE/VO2）、摄氧量相对值（RE/rVO2）、心率（RE/HR）、通气量（RE/VE）等。具体方法如下：先让所有受试者试跑3 min，以适应跑台的运动方式。第1分钟：坡度为0，速度逐渐增加到7.5 km/h，受试者从自然走步移行为跑步，保持2 min。第3分钟：坡度为0，速度增至10.0 km/h，保持2 min。第5分钟：坡度为0，速度增至12.0 km/h（“适宜的极限下负荷速度”），保持5 min。利用气体代谢分析仪实时收集呼出气体，计算运动中耗氧量，当耗氧量曲线达到没有变化的稳定状态时，即可停止运动，此状态下的VO2即为跑节省化值［10］。第10分钟：坡度增加2%，速度增至12.5 km/h。第11分钟后：坡度每分钟增加2%，速度每分钟增加0.5 km/h，视个人能力逐级递增，直至力竭。

VO2max判定标准：（1）连续两次吸氧量变化在5%以下或150 ml/min或2 ml/kg/min以下；（2）呼吸商接近1.1；（3）受试者精疲力竭，虽一再鼓励也无法跟上跑台速度。

通气阈的判定标准：肺通气量、二氧化碳呼出量等指标急剧增加（或非线性增加）的拐点为通气阈。

1.2.3 基因多态性分析

用Promega试剂盒提取全血DNA，PCR扩增：（1）使用Primer Premier 5.0软件自行设计引物，上引物：5’-ggc tta atc ttg tta ggc tct-3’，下引物：5’-cct gct tgg aag tcc ata tct-3’，经blast比对后具有很高的特异性（引物由上海生工合成），PCR产物目的片段长度223bp。（2）PCR扩增体系（15µl）：10×PCR buffer 2µl，25 mMMgCl21.02 µl，dNTP 2µl，5 µM的上下引物各2 µl，Taq酶0.2 ul（5 U/ul）（上海生工），DNA模板100 ng，双蒸水补齐至15 µl。（3）PCR扩增条件：95℃预变性5分钟；95℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸30 s，30个循环；最后72℃延伸7分钟。经2%琼脂糖凝胶电泳（100V跑5分钟，出孔后调成80V跑30分钟），荧光染料（Sybgreen，0.5 µg/ml）染色检测 PCR 产物。（4）限制性片段长度多态分析：限制性内切酶为Sat I，反应体系为 8 µl：10×T Buffer 0.7 µl，双蒸水 2.8µl，Sat I 1 µl（1U），PCR 产物 3.5 µl，37℃水浴 5小时。

1.3 统计学分析

以各指标训练前后变化率［△＝（训练后－训练前）/ 训练前］表示有氧耐力训练敏感性。应用Finetti软件计算Hardy-Weinberg平衡；训练前数据的正态分布情况用K-S方法检验。符合正态分布的，基因型之间各生理指标的初始值及基因型之间的训练敏感性采用单因素方差分析。不符合正态分布或方差不齐的，采用非参数检验。所有数据处理均采用SPSS11.5软件包完成，P < 0.05为差异有统计学意义，P < 0.1为有变化趋势。

2 结果

2.1 IVS3-48T/C多态性解析及分布特征

FECH基因IVS3-48T/C多态位点的PCR产物经Sat I限制性内切酶消化后用2%琼脂糖凝胶电泳（80V跑45分钟），荧光染料（Sybgreen，0.5 µg/ml）染色后紫外光成像，共得到三种条带：有酶切位点的纯合型有152 bp和71 bp两条带（为CC型），没有酶切位点纯合型为223 bp一条带（为TT型），而杂合型（CT型）有223 bp、184 bp和71 bp三条带电泳图及测序图见图1、2。

经统计，IVS3-48T/C多态性在受试者人群中的分布为：CC基因型8人，分布频率为8%；CT基因型46人，分布频率为45%；TT基因型48人，分布频率为47%。基因型分布符合H-W平衡（χ2=0.44，df=1，P = 0.51），具有群体代表性。

图1 FECH基因IVS3-48T/C多态位点PCR-RFLP琼脂糖凝胶分型

图2 FECH基因IVS3-48T/C多态位点测序图

2.2 IVS3-48T/C不同基因型有氧耐力训练前后VO2max、VT的比较

表1显示，训练前，最大摄氧量及通气阈等指标的初始值在各基因型之间均无显著性差异；训练后，TT、TC基因型VT/VO2均升高，而CC基因型下降，TT基因型增加幅度有高于CC型的趋势（P< 0.1），其余均无显著性差异。

2.3 IVS3-48T/C不同基因型有氧耐力训练前后跑节省化的比较

表2显示，训练前，CC型RE/HR初始值显著高于TT型（P < 0.05），有高于CT型的趋势（P< 0.1）；CC型RE/rVO2初始值均显著高于TT型和CT型（P < 0.01）；其余指标初始值在各基因型间均无显著性差异。训练后，TT型RE/HR的下降幅度有高于CC型的趋势（P < 0.1）；TT型RE/VE的下降幅度显著高于CT型（P < 0.05）；其余指标变化率在各基因型间无显著性差异。

表1 FECH基因IVS3-48T/C不同基因型有氧耐力训练前后VO2max、VT的比较

表2 FECH基因IVS3-48T/C不同基因型有氧耐力训练前后RE的比较

3 讨论

有氧运动能力不但是体能类项目运动员必备的能力和素质，也是提高训练效果和比赛成绩的重要保障。有氧运动能力在很大程度上受遗传影响［11，12］，进一步研究发现，引起不同人群运动能力及运动训练敏感性的差异与基因多态性有关［13］。因此，通过与有氧运动能力相关的基因多态性研究，不仅可将运动员选材提高到分子水平，而且可以为个性化耐力训练方案的制定提供分子指标，另外还可为全民健身人群制定个性化运动处方提供依据。

本研究选用体育运动实践中常用的经典指标VO2max、VT、跑节省化等来评定有氧运动能力，并将FECH基因IVS3-48T/C多态与之进行关联研究，结果发现，18周耐力训练前，CC型RE/HR初始值显著高于TT型，有高于CT型的趋势；CC型RE/rVO2初始值均显著高于TT型和CT型，说明IVS3-48T/C多态与RE初始水平存在关联，其中TT型具有较高的跑节省化起始水平。

18周耐力训练后，TT、TC基因型VT/VO2均提高，CC基因型下降，并且TT基因型的增加幅度有高于CC型的趋势。在跑节省化测试指标中，三种基因型RE相关指标均下降，说明受试者均出现机能节省化，但不同基因型间的变化幅度存在明显不同，其中，TT型RE/VE下降幅度显著高于CC和TC基因型，表现出较高的训练敏感性。

RE在评价有氧运动能力方面有出色的应用价值，是目前公认的描述亚极限负荷运动的心肺机能的最佳指标，对运动成绩的贡献率高于VO2max，并且，在评价有氧耐力训练敏感性方面较VO2max有更明显的可塑性［14］。RE是受试者在给定的次最大负荷跑速下运动时的氧耗水平。本实验结果表明，TT基因型不仅具有较高的跑节省化起始水平，即较强的有氧运动能力，并且耐力训练后，出现更显著的机能节省化，即完成相同负荷的训练时，所需通气量较训练前明显下降。肺通气与换气机能是影响人体吸氧能力的先决因素。有研究表明，人类最大有氧能力的个体变异76%归因于遗传，而通气敏感度70%归于遗传［15］。因此，TT基因型不仅与有氧运动能力起始水平存在关联，并且与有氧耐力训练敏感性也存在关联。

目前，有关FECH基因多态性与运动能力的研究未见报道，IVS3-48T/C多态TT基因型与耐力训练效果存在关联的机制可能是：FECH为血红素合成的最后一个酶，直接决定血红素的质量，而血红素又是Hb、Mb、线粒体细胞色素等与氧气转运、氧气利用及能量产生直接相关的血红素类蛋白的辅基，对心肺功能有直接的影响。该多态位点位于第3内含子中，其中等位基因C（即突变型）可导致异常剪接的mRNA被一个无意义密码子介导的降解机制降解，生产出稳定性水平下降的mRNA；并且在内含子3-外显子4序列上游63bp还发现有一个隐藏的受体剪接位点，该隐藏剪接位点会产生出伴有早熟的终止密码的mRNA，IVS3-48C微基因产生40%的异常剪接mRNA，使其稳定性下降。在这两种机制的作用下，使不同基因型的FECH活性产生很大不同，三种基因型的酶活性为TT型 >CT型 > CC型［16］。由此影响血红素代谢途径，并在通气功能的训练敏感性上表现不同。但具体机制有待更深的研究。本课题组将在后续研究中，通过更多的指标评定体系在分子和基因水平上，更深层次地探讨该基因多态性与有氧运动能力的关联机制。

4 总结

FECH基因IVS3-48T/C多态性中，TT基因型不仅与有氧耐力起始水平存在关联，还与有氧耐力训练敏感性存在关联，可作为预测有氧耐力训练敏感性的分子标记。

［1］Tsiftsoglou AS，Tsamadou AI，Papadopoulou LC.Heme as key regulator of major mammalian cellular functions：Molecular，cellular and pharmacological aspects.Pharmacol Ther，2006，111（2）：327-345.

［2］Ponka P. Cell biology of heme. Am J Med Sci，1999，318（4）：241-256.

［3］Ogawa K，Sun J，Taketani S，et al. Heme mediates derepression of Maf recognition element through direct binding to transcription repressor BachI. EMBO J，2001，20（11）：2835-2843.

［4］Sassa S. Heme stimulation of cellular growth and differentiation. Semin Hematol，1988，25（4）：312-320.

［5］Gatta LB，Vitali M，Verardi R，et al. Inhibition of heme synthesis alters Amyloid Precursor Protein processing. J Neural Transm，2009，116（1）：79-88.

［6］Navarro S，Del Hoyo P，Campos Y，et al. Increased mitochondrial respiratory chain enzyme activities correlate with minor extent of liver damage in mice suffering from erythropoietic protoporphyria. Exp Dermatol，2005，14（1）：26-33.

［7］Bloomer J，Wang Y，Singhal A，et al. Molecular studies of liver disease in erythropoietic protoporphyria. J Clin Gastroenterol，2005，39（4 Suppl 2）：S167-75.

［8］Lyoumi S，Abitbol M，Andrieu V，et al. Increased plasma transferrin，altered body iron distribution，and microcytic hypochromic anemia in ferrochelatase-deficient mice. Blood，2007，109（2）：811-818.

［9］Saunders PU，Pyne DB，Telford RD，et al. Factors affecting running economy in trained distance runners.Sports Med，2004，34（7）：465-485.

［10］Beneke R，Hutler M. The effect of training on running economy and performance in recreational athletes. Med Sci Sports Exerc，2005，37（10）：1794-1799.

［11］Timmons JA，Jansson E，Fischer H，et al. Modulation of extracellular matrix genes reflects the magnitude of physiological adaptation to aerobic exercise training in human. BMC Biol，2005，3 ：19.

［12］Timmons JA，Larsson O，Jansson E，et al. Human muscle gene expression responses to endurance training provide a novel perspective on Duchenne muscular dystrophy. FASEB J，2005，19（7）：750-760.

［13］Shastry BS. SNP alleles in human disease and evolution. J Hum Genet，2002，47（11）：561-566.

［14］席翼，张得保，王国军，等. 跑节省化评价有氧耐力及其训练效果实验研究. 中国运动医学杂志，2008，27（1）：15-19.

［15］马力宏. 人类体质及运动能力的遗传学基础. 天津体育学院学报，2001，16（4）：1-5.

［16］Bloomer JR，Wang Y，Singhal A，et al. Biochemical abnormality in erythropoietic protoporphyria：Cause and consequences. J Pediatr Gastroenterol Nutr，2006，43（Suppl 1）：S36-40.