男子田径运动员负重运动后外周血淋巴细胞凋亡的变化及其机制分析

周义义 傅博 朱荣 温州大学体育学院（温州 505） 辽宁省足球运动管理中心 温州医学院

大强度运动可造成运动性免疫抑制，与运动诱导的淋巴细胞凋亡有关［1-3］。近年来，关于运动与免疫细胞凋亡的研究主要集中在不同运动强度对淋巴细胞凋亡的影响。研究表明，剧烈运动或力竭运动可显著诱导淋巴细胞凋亡和DNA损伤［4］，而中等强度运动（65%～70%VO2max）对淋巴细胞凋亡的影响仍有争议［5-7］。肌肉剧烈收缩易造成运动性肌肉损伤、延迟性肌肉酸痛和运动性疲劳［8］，也是造成运动性免疫抑制的重要诱因［9］，但机制未明。本研究以负重运动造成肌肉损伤为模型［10］，探讨其对外周血淋巴细胞凋亡的影响并分析可能机制。

1 对象与方法

1.1 研究对象

16名温州体育运动学校的男子田径运动员（二级）自愿参加本实验，年龄（14.5±1.4）岁，身高（1.75±0.12）m，体重（67.8±4.6）kg，训练年限（4.8±0.7）年。所有运动员身体健康，无心血管疾病、急慢性感染、骨关节疾病及其他疾病史，近期无服药史，无吸烟、饮酒等不良嗜好。

1.2 运动方案与取血

受试者在实验前72 h内均无剧烈运动，实验前一晚至少睡眠8 h。清晨空腹肘正中静脉采血5 ml后休息15 min，然后进行一次急性负重离心运动。方案如下［10］：受试者采用背包负重，重量为各自体重的30%，先进行5 min台阶试验（台阶高30 cm，登阶频率为54步/min，用节拍器控制），紧接着完成15次蹲起，3 s蹲下，2 s站起（延长离心收缩时间）。运动后即刻和运动后2 h、4 h、8 h、12 h、24 h和48 h静脉采血5 ml，EDTA抗凝。

1.3 血清CK和皮质醇

取抗凝血离心分离血清，使用试剂盒（南京建成生物工程研究所）并严格按照操作说明进行。测试仪器：血清CK使用MD-100半自动生化分析仪（美国伯明斯顿公司）测定，血清皮质醇使用FMQ-9013C型γ放免分析仪（唐山市晨曦电子有限公司）测定。

1.4 淋巴细胞的分离

取新鲜肝素钠抗凝血3 ml，加入0.375 ml淋巴细胞分离液，混匀，800g室温离心30 min，取出白色绒毛状的淋巴细胞层，即外周血单个核细胞，用RPMI1640液洗涤，400g离心10 min，弃上清，用含10% 胎牛血清的RPMI1640液重悬细胞，置入培养皿，调细胞密度5×108～1×109/L。利用单核细胞贴壁特性，取非贴壁细胞悬液少许，经瑞氏染色后油镜下检测形态，证实为淋巴细胞。

1.5 淋巴细胞凋亡率

用冷PBS调至淋巴细胞为5×108~1×109/L，加入0.8 ml含RNase的碘化丙啶（PI），4℃避光15 min。FACS 420流式细胞仪（美国BD公司）检测淋巴细胞凋亡率。

1.6 淋巴细胞Bax/Bcl-2和Fas/FasL的表达

淋巴细胞裂解后用考马斯亮蓝法测定蛋白含量，蛋白样品经15% SDS-PAGE分离转移于PVDF膜。一抗（美国Santacruz公司）孵育过夜，HRP标记二抗（天津TBD公司）孵育1小时，ECL显影。采用凝胶系统分析软件扫描各条带灰度值，以对照组运动前条带为100%，其它各条带与其比值，即其相对表达量（%），actin为内参蛋白。

1.7 统计学分析

所有数据均用SPSS 15.0统计软件包进行处理，结果用平均数±标准差表示，各组比较采用单因素方差分析，P < 0.05为显著性水平，P < 0.01为非常显著水平。

2 结果

表1显示，淋巴细胞凋亡率在运动后呈先上升后下降的变化趋势，运动后24 h达峰值，其中运动后即刻和运动后2 h、4 h、8 h、12 h、24 h和48 h均较运动前显著性升高（均为P < 0.01），运动后48 h较运动后24 h显著性下降（P < 0.01）；血清CK和Bax/Bcl-2亦呈先升高后下降的并行性变化趋势，其中运动后12 h、24 h和48 h均较运动前显著性升高（均为P < 0.01），运动后24 h达峰值，运动后48 h较运动后24 h显著性下降（P < 0.01；P < 0.05）；Fas/FasL在各时间点均无显著性变化（P> 0.05）；血清皮质醇在运动后即刻、运动后2 h、4 h、8 h、12 h均较运动前显著性升高（均为P < 0.01），运动后12 h达峰值，运动后24 h恢复至运动前水平（P > 0.05）。

表1 淋巴细胞凋亡率、血清CK、皮质醇、Fas/FasL、Bax/Bcl-2的时程变化

3 讨论

本研究发现，一次急性负重运动后外周血淋巴细胞凋亡率在运动后即刻开始升高，24 h达峰值，48 h开始下降但仍高于运动前水平。Tuan等［11］发现，30 min大强度运动后淋巴细胞凋亡率显著升高并一直持续到运动后72 h，与本研究的结果相似。这提示大强度不习惯的离心运动可诱导淋巴细胞凋亡增加并持续数天，因此可能是运动性免疫抑制发生的原因之一。

肌肉进行大强度运动（特别是离心运动）易发生运动性肌肉损伤，可能与肌细胞受到强烈的机械牵拉以及胞内代谢产物的变化有关［12］。肌细胞的机械牵拉（机械性损伤）可使Z盘断裂、肌节降解，局部组织损伤以及膜通透性增高；剧烈运动造成肌细胞的能量耗竭（代谢性损伤），胞内钙离子浓度升高并激活钙依赖的蛋白激酶，破坏骨架蛋白（肌节），同时激活钾离子通道使膜电阻下降，通透性增高。肌肉损伤后，细胞内容物透过肌膜漏出入血，造成血中非功能蛋白升高，其中血清CK是肌肉损伤的特异标志物［13］。本研究以负重运动为干预模型，其肌肉收缩的方式以离心运动为主（也包括向心运动），运动后12 h血清CK显著升高，24 h达峰值，48 h开始下降，但仍高于运动前，这与Heled等［10］的研究结果一致，提示一次急性负重运动造成的肌肉损伤可持续2～3天，并发生肌纤维降解现象［14］。研究表明，运动后数天发生的继发性肌肉降解可能与单核细胞释放自由基有关［15］。肌肉进行急性运动时产生大量自由基，不仅与运动时细胞的无氧代谢有关，而且与免疫细胞的吞噬作用造成的继发性炎症反应关系密切［15］。此外，损伤的肌细胞内容物外漏入血并刺激循环中的淋巴细胞产生自由基的增多（氧化应激），进而导致淋巴细胞凋亡增加［15，16］。结合本研究中CK与淋巴细胞凋亡率的变化，推测一次急性负重运动后12～24 h肌肉产生的损伤性变化参与了对该时期淋巴细胞凋亡的调控。

细胞凋亡的途径包括死亡受体介导的信号通路和线粒体介导的信号通路。死亡受体介导的信号通路是通过Fas和Fas配体（FasL）结合而启动凋亡［17］。Ostrowski等［18］的研究指出，大强度运动导致肌肉释放促炎症因子如TNF-α、IL-6、IL-1β等，可引发死亡受体介导的凋亡信号通路。由于本研究中Fas和FasL在各时间点均无变化，因此不支持上述结论，可能与实验模型（运动强度、运动时间等）有关。线粒体介导的信号通路是通过Bcl-2超家族蛋白的表达实现的［19］。Bax是促凋亡因子，在体内形成同二聚体，改变线粒体膜电位，增加线粒体通透性转换孔的开放，促进细胞色素C等物质进入胞浆，激活Caspase，引起细胞凋亡［20］；而Bcl-2表达上调可使细胞内还原型谷胱甘肽（GSH）增加［21］，清除自由基，保护细胞免受氧化应激损伤并抑制细胞凋亡发生［22］。因此，Bcl-2和Bax是通过改变氧化应激水平调节细胞凋亡的［23］。研究表明，单独Bax或Bcl-2的变化并不能完全代表细胞凋亡命运，Simon等［24］的研究证实，Bax/Bcl-2比值的变化决定了细胞凋亡或存活。在本研究中，Bax/Bcl-2在运动后12 h显著升高，24 h达峰值，48 h仍高于运动前水平，说明负重运动诱导的淋巴细胞凋亡主要是通过线粒体介导的信号途径实现的。另外，Bax/Bcl-2的变化与血清CK基本一致，进一步提示负重运动导致的肌肉损伤可能参与了外周血淋巴细胞凋亡的增加。研究表明，损伤的肌细胞内容物外漏入血并刺激循环中的吞噬细胞产生ROS和活性氮［25］，此外，运动时肌肉产生的ROS随着肌肉损伤而释放入血［26］。自由基的增多（氧化应激）启动了胞浆的信号链式反应，导致p53蛋白磷酸化，从而升高Bax并降低Bcl-2［27］，改变了细胞内促凋亡和抗凋亡蛋白之间的稳态平衡，破坏线粒体膜电位和DNA结构，引发线粒体介导的凋亡信号通路［28］。

本研究中，淋巴细胞凋亡率在运动后即刻至运动后48 h均显著升高，而血清CK和Bax/Bcl-2在运动后12 h才显著升高，提示其他因素参与了淋巴细胞的早期凋亡。细胞培养实验证实，皮质醇（糖皮质激素）可诱导外周血淋巴细胞凋亡［29］。本研究发现，血清皮质醇在一次急性负重运动后即刻显著升高，12 h达峰值，24～48 h恢复至运动前水平，这与Kruger等［30］的最新研究一致，他们发现，一次大强度抗阻训练后血清皮质醇显著升高，24 h恢复，并证实大强度抗阻训练诱导的淋巴细胞凋亡是通过糖皮质激素受体途径介导的。因此，本研究的结果提示，皮质醇的升高参与了负重运动诱导的淋巴细胞早期凋亡。

4 总结

负重运动可诱导外周血淋巴细胞凋亡，其机制与运动性肌肉损伤、应激激素（皮质醇）升高和线粒体氧化应激有关。

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