大豆苷元干预Hedgehog信号通路调控去卵巢骨质大鼠基质金属蛋白酶代谢

白登彦 王冠 张海军 朱涛 赵志鹏

1.甘肃省第二人民医院，甘肃 兰州 730015 2.西北民族大学附属医院，甘肃 兰州 730015

骨质疏松(osteoporosis，OP)主要表现为骨微结构改变及骨强度降低，其发病机制与雌激素降低等多种因素有关。研究发现[1-2]，基质金属蛋白酶代谢对成骨细胞的分化、增殖及代谢起关键作用，其中基质金属蛋白酶-7(matrix metalloproteinase-3，MMP-7)和基质金属蛋白酶组织抑制剂-1(tissue inhibitor of metalloproteinases 1，TIMP-1)的含量变化与OP发病存在密切关系[3-4]。大豆苷元是大豆异黄酮的主要成分之一，与17β-雌二醇的结构相似，研究指出[5]，大豆苷元能够干预破骨细胞的形成，调控骨质疏松过程，但机制不明确。研究发现[6]，刺猬(Hedgehog，Hh)信号通路与雌激素通路有相互促进作用，而且能干预成骨细胞，调控骨细胞生长和增殖。本研究通过大豆苷元浓缩液灌胃干预OP模型大鼠，探究大豆苷元对Hedgehog信号通路的调控作用，并分析其对基质金属蛋白酶代谢的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雌性SPF级20周龄Wistar大鼠60只(购自甘肃中医药大学实验动物中心，动物合格证号SCXK(甘)2020-0001)，体质量(200±20)g，饲养于甘肃中医药大学SPF动物中心，适应性自由进食、饮水，1周后进行OP实验造模。

1.2 药物、试剂及仪器

大豆苷元(北京药品生物制品检定所，纯度>98%，批号：20001)，血清雌激素(E2)、骨钙素(BGP)、血清碱性磷酸酶(ALP)试剂盒(上海信帆生物，批号：E202009P、E202041P、E202033P)。PBS缓冲液(北京蓝博斯特)，琼脂糖(济南汇锦川)，TRIZOL试剂(北京莱博润科)，兔多克隆抗体PTC1、Gli1、Shh(美国Sigma，批号：47014、43022、42150)；羊抗兔二抗(美国Thermo，批号：QE225340)；SDS-PAGE试剂盒(批号：45420)、PCR试剂盒(批号：45525)、BCA检测试剂盒(批号：48751)、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(批号：76330)、ECL试剂盒(批号：98417)均购自美国CST公司，奥林巴斯光学显微镜(JAPAN)；PCR热循环仪及荧光定量PCR仪(美国伯乐)。

1.3 动物分组、造模及处理

将60只大鼠按随机数字法分为假手术组、模型组、大豆苷元治疗低、中、高剂量组共5组，每组12只。除假手术组外，其他组大鼠按照参考文献[7]，腹腔麻醉后，沿腹中线剑突下切口，分离中下腹部肌肉，打开腹膜，暴露大鼠腹腔，切除双侧卵巢后制备OP模型。术后控制饮食，自由饮水。造模成功后开始灌胃治疗，假手术组及模型组给予等剂量生理盐水灌胃，大豆苷元低、中、高剂量组大鼠分别按人鼠比例2.42、4.84、9.68 mg/(kg·d)灌胃治疗，1次/d，共持续12周。灌胃结束24 h后，大鼠股动脉取血5 mL，迅速离心并提取上清液保存。处死大鼠后取股骨组织样品4份保存备用。

1.4 指标处理及检测

1.4.1ELISA检测：取上清液，参照ELISA试剂操作说明，检测各组大鼠血清中血清E2、BGP、ALP含量水平变化。

1.4.2免疫组化检测：取各组大鼠股骨组织进行石蜡包埋切片，脱蜡后水洗进行抗原修复后室温孵育过夜，PBS洗涤3次，室温孵育60 min，滴加一抗二抗后，PBS洗涤3次，DAB在显微镜下染色，高倍镜下(×400)观察各组标本中MMP-7及TIMP-1阳性染色情况，并进行半定量分析。

1.4.3TUNEL法检测：取各组大鼠股骨组织，常规方法石蜡切片后二甲苯洗涤2次，每次5 min，梯度乙醇浸洗后PBS漂洗细胞通透液处理，加入含过氧化氢的PBS漂洗后加入TUNEL反应混合液于标本上检测标本中各组大鼠骨组织细胞凋亡情况，显微镜下记录并拍照。

1.4.4RT-PCR法检测：RNA抽提试剂盒提取各组大鼠骨组织中总RNA，反转录获取各组cDNA后设计引物序列，参考RT-PCR实验方法对各组Shh、PTC1、Gli1 mRNA表达量进行检测，内参为甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)，采用 2-ΔΔCt方法分析不同组别mRNA表达量。引物序列见表1。

表1 PCR扩增引物序列Table 1 PCR primer sequences

1.4.5Western blot检测：各组股骨组织中加入RIPA裂解缓冲液提取样本中的总蛋白，参照BCA检测说明测定各组股骨组织中蛋白的含量。SDS-PAGE将蛋白质等量分离，4 ℃条件下PDVF膜上添加一抗孵育过夜。PBS洗涤后常温下添加二抗2 h孵育。ECL试剂显影后应用软件Quantity One测定PTC1、Gli1、Shh蛋白表达水平。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 血清E2、BGP、ALP水平变化

与假手术组大鼠对比，模型组大鼠的BGP、ALP升高，E2含量降低，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组对比，大豆苷元治疗组BGP、ALP含量降低，E2含量升高(P<0.05)，且大豆苷元随剂量增加治疗效果更加明显(P<0.01)。见表2。

表2 不同组大鼠血清E2、BGP、ALP含量对比

2.2 股骨组织中MMP-7及TIMP-1蛋白含量变化

免疫组化染色结果显示，模型组大鼠组织中MMP-7及TIMP-1表达明显增多；干预治疗后，各治疗组MMP-7及TIMP-1表达明显减少，其中大豆苷元随剂量增加治疗效果更加明显(P<0.01)。见图1，表3。

图1 大鼠骨组织中MMP-7及TIMP-1含量对比(×400)Fig.1 Comparison between MMP-7 and TIMP-1 contents in bone tissue of rats(×400) 注：A：假手术组，B：模型组，C：大豆苷元低剂量组，D：大豆苷元中剂量组，E：大豆苷元高剂量组。

表3 大鼠骨组织中MMP-7及TIMP-1含量对比

2.3 股骨组织细胞凋亡情况比较

蓝色荧光为正常细胞核，绿色荧光为凋亡细胞。镜下显示，假手术组大鼠骨组织正常，绿色荧光极少；模型组大鼠造模后绿色荧光增多，提示凋亡细胞增加；干预治疗后，各治疗组大鼠股骨远端细胞凋亡数量减少，其中大豆苷元随剂量增加治疗效果更加明显。见图2。

图2 各组大鼠股骨远端细胞凋亡情况(×200)Fig.2 Apoptosis of the distal femur cells in each group(×200)

2.4 股骨组织中PTC1、Gli1、Shh mRNA表达水平

与假手术组对比，模型组大鼠股骨组织中PTC1、Gli1、Shh mRNA表达升高(P<0.05)。与模型组对比，各治疗组PTC1、Gli1、Shh mRNA含量明显降低(P<0.05)，且大豆苷元的治疗效果随剂量增加更加明显(P<0.01)。见图3。

图3 股骨组织中PTC1、Gli1、Shh mRNA表达量比较Fig.3 Comparison among PTC1, Gli1, and Shh mRNA expression in the femur注：A：假手术组，B：模型组，C：大豆苷元低剂量组，D：大豆苷元中剂量组，E：大豆苷元高剂量组。与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，▲P<0.05。

2.5 股骨组织中PTC1、Gli1、Shh蛋白表达水平

与假手术组对比，模型组股骨组织中PTC1、Gli1、Shh蛋白表达升高(P<0.05)。与模型组对比，各治疗组PTC1、Gli1、Shh蛋白含量表达降低(P<0.05)，且大豆苷元的治疗效果随剂量增加更加明显(P<0.01)。见图4。

图4 股骨组织中PTC1、Gli1、Shh蛋白表达对比Fig.4 Comparison among PTC1, Gli1, and Shh protein expression in the femur注：A：假手术组，B：模型组，C：大豆苷元低剂量组，D：大豆苷元中剂量组，E：大豆苷元高剂量组。与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，▲P<0.05。

3 讨论

雌激素替代治疗是雌激素缺乏导致的OP的主要治疗方法，但其禁忌症较多[8]。植物激素存在与雌激素相似的功能和结构，其中部分植物激素在组织中能够选择性地与雌激素受体(ER)结合，发挥弱雌激素样活性作用。大豆苷元是一种具有类似雌激素功能的非甾类化合物。研究显示[9-10]，大豆苷元能够有效抗雌激素活性，改善骨损伤，干预成骨细胞的形成，但其具体机制不详。

血清E2浓度是反映绝经后机体雌激素水平最重要的一种激素[11]。BGP和ALP由成骨细胞分泌产生，其表达水平能够体现骨形成与骨吸收的过程，是评估骨质量的关键指标[12]。本研究结果显示，在摘除大鼠卵巢后，大鼠E2含量明显降低，BGP、ALP含量升高，证明大鼠在造模后雌激素降低，骨质量发生改变，经过大豆苷元干预后，OP大鼠E2明显升高，BGP、ALP含量明显降低，说明OP大鼠在大豆苷元干预后，雌激素水平及骨的发育得到一定改善。MMP-7是骨吸收过程中具有降解细胞外基质作用的酶，在OP发病过程中MMP-7过表达可降解细胞外蛋白多糖、IX型胶原等多种基质蛋白产物，影响骨组织平衡状态下基质的合成与分解，加速骨吸收过程[13]。TIMPs作为金属蛋白酶抑制因子，对组织中的间质胶原酶以及间质溶解素具有特异性，可直接与活化的MMPs家族形成1∶1复合体进而抑制MMPs活性，降低MMP-7对骨组织的损害[14]。本研究显示，OP大鼠的骨组织在造模后MMP-7及TIMP-1蛋白含量发生明显变化，MMP-7表达增高，TIMP-1表达降低，经大豆苷元干预治疗后，MMP-7及TIMP-1蛋白含量发生明显改善，这说明大豆苷元干预了骨组织中MMP-7及TIMP-1的蛋白表达。

Hh信号通路是骨细胞分化过程中的关键通路之一，与骨细胞形成及骨代谢疾病存在密切关系[15]。在骨细胞分化过程中，Hh信号通路的关键受体音猬因子(Shh)与下游基因12次跨膜蛋白Ptched1(Ptch1)和胶质瘤相关肿瘤基因同源物 1(Gli-1)在成骨细胞中表达，进而促进骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞和软骨细胞[16-17]。骨缺损和骨再生过程中Shh含量变化可激发骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化，这是促进骨组织生成的关键因素[18]。正常骨组织中Hh信号活性较低，当激发骨细胞分化时，Hh通路中关键的因子含量发生明显变化，其中关键因子Gli1能够调控膜型金属基质蛋白酶(MTI-MMP)的表达来促进细胞的迁移和侵袭，而Shh表达变化与MMP-7及TIMP-1存在密切联系[19-20]。本研究也表明，OP大鼠造模成功后，骨组织细胞凋亡明显增加，基质金属蛋白酶发生改变，PTC1、Gli1、Shh蛋白及基因表达也发生明显改变，这说明Hh信号通路参与了OP的发病过程。而且本实验还证实，大豆苷元干预OP大鼠后，大鼠骨细胞凋亡情况显著改善，而骨组织中Hh信号通路相关蛋白基因及基质金属蛋白酶也发生明显改善，这也证明大豆苷元有效调控了OP大鼠Hh信号通路的表达，影响细胞凋亡过程，干预了基质金属蛋白酶代谢，进而影响OP的发病过程。

综上所述，大豆苷元可调控Hh信号通路，影响基质金属蛋白酶代谢，干预骨细胞凋亡过程，但其干预的具体机制仍需深入研究。