高脂饲料对不同月龄小鼠骨质疏松的影响

阳玉珍 冯湘玲 张妍薇 孙玥 许菁菁 陈继华

中南大学湘雅公共卫生学院，湖南 长沙 410078

骨质疏松症(osteoporosis，OP)是一种以骨量低、骨组织退化和骨结构破坏为特征的常见骨骼疾病，容易导致骨质疏松性骨折[1-2]。骨质疏松与年龄增长有关，随着我国人口老龄化日趋严重，其已成为我国严重的公共卫生挑战[3]。有研究预测，在2050年我国骨质疏松性骨折患者将接近600万人，这将成为我国沉重的经济负担[4]。因此越来越多研究关注老年人骨健康。

近年来有研究表明肥胖可加剧骨质疏松，高脂饮食可抑制老年人和大鼠骨骼系统中成骨细胞形成，降低骨矿物质含量，从而对骨质量产生负作用[5-6]。也有研究发现高脂饲料喂养的小鼠骨小梁较正常饲料组稀疏，小鼠内脏脂肪/体重的值与骨密度呈负相关，提示高脂饮食所致的肥胖可能会引起骨质破坏，而高脂饮食引起的炎症介质表达上调及氧化应激增加可能是骨质破坏的原因之一[7]。但高脂饮食在不同年龄阶段对机体骨骼系统的影响是否一致，目前尚无明确结论。因此，本研究拟用正常和高脂饲料喂养2月龄和8月龄小鼠，观察不同饲料对不同月龄小鼠血脂、氧化应激和炎症水平、骨代谢及骨微观结构等指标的变化，比较高脂饲料对不同月龄小鼠骨骼健康的影响，为进一步明确高脂饮食对不同月龄小鼠骨质量的影响提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1实验动物及材料：SPF级2/8月龄雄性C57BL/6J小鼠购于北京维通利华动物实验技术有限公司，动物许可证号SCXK(京)2016-0006。动物饲料购买于Research Diets公司，高脂和正常饲料分别采用60%脂肪供能(D12492)和10%脂肪供能(D12450J)的小鼠饲料。所有程序经中南大学湘雅公共卫生学院动物伦理委员会批准(伦理编号：XYGW-2018-14)。

1.1.2主要实验试剂与设备：EDTA脱钙液(Boster，美国)；甘油三酯测定试剂盒、总胆固醇测定试剂盒、高密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒、低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒(南京建成，中国)。全波段酶标仪(赛默飞，美国)；倒置荧光显微镜(Invitrogen，美国)等。

1.2 实验方法

1.2.1动物饲养：2月龄和8月龄雄性C57BL/6J小鼠各16只，适应性喂养2周后，均随机分为两组，每组8只，分别为6月龄正常饲料组、6月龄高脂饲料组、12月龄正常饲料组、12月龄高脂饲料组。喂养16周后处死，进行后续实验。

1.2.2标本的采集与处理：小鼠喂养结束后摘眼球取血，全血在4 ℃静置8 h，于3 000 r/min离心15 min后收集上层血清。小鼠左侧股骨用含生理盐水纱布包裹后置于-20 ℃，右侧股骨用4%多聚甲醛固定。

1.2.3血脂指标检测：用生化检测试剂盒检测总胆固醇(TG)、甘油三酯(TC)、低密度脂蛋白肝固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白肝固醇(HDL-C)水平。取血清加至96孔板，加入工作液后37 ℃水浴，于510 nm或546 nm波长下检测吸光度值。

1.2.4葡萄糖耐量试验和胰岛素耐量试验：小鼠饲养第15周时进行葡萄糖耐量试验(GTT)和胰岛素耐量试验(ITT)：小鼠禁食12 h后自由饮水，以2 g/kg体重腹腔注射葡萄糖溶液和0.6 U/kg体重腹腔注射胰岛素溶液，分别在注射前和注射后15、30、60、120 min进行尾静脉采血，血糖试纸检测血糖浓度。

1.2.5氧化应激、炎症和骨代谢标志物检测：用ELISA试剂盒检测小鼠血清中白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和Ⅰ型前胶原N端前肽(PINP)、Ⅰ型前胶原C端肽(CTX-1)的水平。用生化试剂盒检测血清中超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)。将血清样品或标准品加至96孔板，37 ℃孵育2 h，加入各工作液和洗涤液并弃掉，加入终止液混匀后于450 nm波长下检测吸光度值。

1.2.6微计算机断层扫描技术：使用微计算机断层扫描技术(Micro-CT)对小鼠左侧股骨远端进行扫描。设定扫描参数：60 kV，133 uA，单次曝光时间500 ms，扫描分辨率9 μm，扫描角度间隔0.5度。扫描完成后分析骨体积分数(BV/TV)、骨表面密度(BS/TV)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁间隙(Tb.Sp)等指标。

1.2.7骨组织形态学观察：将多聚甲醛固定后的股骨至于EDTA脱钙液中，将成功脱钙的骨组织送至武汉塞维尔生物科技有限公司进行包埋、切片及HE染色。将HE染色片置于显微镜下拍照。每组在骨小梁附近随机选取3个100×镜下视野对破骨细胞计数。

1.2.8质量控制：实验中各小鼠均随机分组，饲养温室(22±2)℃，湿度50%～60%，12 h明暗交替，自由摄食、饮水。各指标随机选取至少3只小鼠标本进行检测，各组样品检测在同样条件下进行。

1.3 统计学分析

采用SPSS 18.0进行统计学分析，结果用均数±标准差表示，采用单因素方差分析进行多组间的比较，LSD法进行两两比较，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 高脂饲料对不同月龄小鼠体型和体重的影响

饲养开始时，各年龄组中正常饲料组和高脂饲料组小鼠体重差异无统计学意义。饲养16周后，与正常饲料组相比，6月龄和12月龄高脂饲料组小鼠体型均增大。从不同饲料组看，6月龄和12月龄高脂饲料组小鼠的体重和体脂率均高于其正常饲料组(P<0.05)。见图1、2。

图1 高脂饮食对不同月龄小鼠体型的影响Fig.1 Effect of HFD on body size at mice at different months of age

图2 小鼠体重变化(A)和小鼠体重增长(B)情况Fig.2 Changes in body weight (A) and weight growth (B) of mice注：n=6，与正常饲料组相比，*P<0.05；与6月龄组相比，#P<0.05；ns：P≥0.05。

2.2 高脂饲料对不同月龄小鼠血脂血糖的影响

从不同饲料组来看，6月龄高脂饲料组的TC、TG高于其正常饲料组，12月龄高脂饲料组的TC、TG、LDL-C也高于其正常饲料组(P<0.05)。从不同月龄组看，12月龄正常饲料组的TC、TG、LDL-C均高于6月龄正常饲料组，12月龄高脂饲料组的TC、LDL-C高于6月龄高脂饲料组(P<0.05)。血清FFA在各组间差异比较无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组小鼠血脂水平Table 1 Blood lipid levels of mice

6月龄和12月龄高脂饲料组小鼠GTT、ITT水平较正常饲料组升高，其曲线下面积均大于正常饲料组(P<0.05)。从不同月龄组看，12月龄正常饲料组的GTT曲线下面积高于6月龄正常饲料组(P<0.05)。GTT和ITT曲线下面积均在12月龄高脂饲料组最高。见图3。

图3 高脂饮食对小鼠ITT(A、B)、GTT(C、D)水平的影响Fig.3 Effect of HFD on ITT (A, B) and GTT (C, D) in mice注：n=3，与正常饲料组相比，*P<0.05；与6月龄组相比，#P<0.05；ns：P≥0.05。

2.3 高脂饲料对不同月龄小鼠骨微观结构的影响

与6月龄和12月龄正常饲料组相比，高脂饲料组小鼠的骨量丢失明显，骨质减少，骨微结构被破坏；且12月龄各饲料组小鼠骨量也较6月龄各饲料组减少。12月龄高脂饲料组小鼠骨微结构破坏最为明显。见图4。

图4 小鼠股骨远端干骺端三维重建图Fig.4 3D reconstruction of the metaphysis of the distal femur in mice

从不同饲料组看，各月龄高脂饲料组BV/TV、BS/TV低于正常饲料组(P<0.05)；从不同年龄组看，12月龄正常饲料组和高脂饲料组BV/TV和BS/TV低于6月龄组。与正常饲料组相比，12月龄高脂饲料组小鼠Tb.Th、Tb.Sp增高，Tb.N、TBPf降低(P<0.05)；12月龄高脂饲料组DA值与12月龄正常饲料组和6月龄高脂饲料组相比均降低(P<0.05)。见表2。

表2 各组小鼠Micro-CT骨参数水平Table 2 Micro-CT bone parameter of mice

2.4 高脂饲料对不同月龄小鼠股骨远端组织形态的影响

6月龄和12月龄高脂饲料组小鼠股骨远端骨小梁数目较其正常饲料组减少，均可见圆形脂肪空泡。从不同年龄组看，12月龄各饲料组骨小梁均明显比6月龄各饲料组少。比其他组相比，12月龄高脂饲料组小鼠股骨远端脂肪空泡明显最多，而骨小梁数目最少。见图5。

图5 小鼠股骨远端HE染色图(100×)Fig.5 HE staining of the distal femur of mice (100×)

图6A中红色框内即为破骨细胞，从不同饲料组看，6月龄和12月龄高脂饲料组破骨细胞数均比其正常饲料组增多(P<0.05)；从不同年龄组看，12月龄各饲料组破骨细胞数均多于6月龄组(P<0.05)。见图6。

图6 小鼠股骨远端HE染色图中破骨细胞形态(A)和100×视野下破骨细胞数目(B)Fig.6 Morphology (A) and number in 100× field (B) of osteoclasts in HE staining of the distal femur of mice注：n=3，与正常饲料组相比，*P<0.05；与6月龄组相比，#P<0.05；ns：P≥0.05。

2.5 高脂饲料对不同月龄小鼠氧化应激和炎症水平的影响

从不同饲料组看，6月龄高脂饲料组血清IL-6、TNF-α、 MDA水平均高于其正常饲料组，12月龄高脂饲料组血清IL-6、TNF-α、MDA水平也高于其正常饲料组(P<0.05)。见表3。

表3 各组小鼠氧化应激和炎症水平Table 3 Oxidative stress and inflammation levels of mice

2.6 高脂饲料对不同月龄小鼠骨代谢指标的影响

从不同饲料组看，6月龄高脂饲料组CTX-1、PINP水平均高于其正常饲料组；12月龄高脂饲料组CTX-1低于其正常饲料组，PINP却明显升高(P<0.05)。从不同月龄组看，与6月龄正常饲料组相比，12月龄正常饲料组CTX-1水平升高，PINP降低。见图7。

图7 高脂饮食对小鼠CTX-1(A)和PINP(B)的影响Fig.7 Effect of HFD on CTX-1 (A) and PINP (B) in mice注：n=3，与正常饲料组相比，*P<0.05；与6月龄组相比，#P<0.05。

3 讨论

近年来调查显示，我国居民脂肪供能比超过中国居民膳食指南(2016年)推荐的人越来越多[8]。长期摄入高脂饮食易导致脂肪蓄积而引起肥胖[9]。本研究通过16周的高脂饲料喂养小鼠以模拟高脂饮食诱导的肥胖现象，饲养结束时发现高脂饲料组小鼠体重和体脂率增加，血脂水平也增加。有研究发现在超重和肥胖的健康人群中，骨密度会随之下降[10-11]。与上述研究结果一致的是，本研究发现在肥胖小鼠骨组织中脂肪空泡明显增加，各月龄高脂饲料组小鼠较正常饲料组骨质破坏明显，骨小梁减少，且在12月龄高脂饲料组小鼠最为明显，这提示高脂和高龄均可损害小鼠骨健康，且高脂与年龄增加同时存在时损害作用更明显。

血清PINP是Ⅰ型胶原合成过程中产生的骨形成标志物；CTX-1是以破骨细胞活性增强为特点的代谢性骨病常用的骨吸收标志物[12]。本研究中各月龄高脂饲料组小鼠血清PINP水平均较正常饲料组升高，且在12月龄高脂组中最高，提示高脂饮食和增龄可使小鼠体内的PINP水平升高。有学者认为PINP增高与髋部皮质骨间隙增大、厚度减小有关，这可能是骨膜贴壁和皮质重建增加所致，这些骨骼结构变化容易致骨折[13]。6月龄高脂饲料组小鼠的CTX-1水平高于其正常饲料组，但在12月龄高脂饲料组中该值却低于其正常饲料组，这可能与小鼠的性别和年龄有关。有研究对多名24～76岁对象检测后发现年龄与CTX-1浓度降低有关，30～59岁各年龄段男性CTX-1与腰椎BMD无相关性[14-15]。虽然12月龄高脂饲料组中CTX-1值低于其正常饲料组，但HE染色显示破骨细胞数目在12月龄高脂饲料组中最多，提示高脂饮食和高龄均促使小鼠破骨细胞增多，即高脂和年龄增加可破坏骨代谢平衡，增强骨吸收，使骨量减少。

在人群和动物中均有研究发现IL-6和TNF-α与骨密度呈负相关[16-17]。TNF-α可通过调节机体氧化应激、炎症反应等来调控骨代谢，如刺激IL-6、M-CSF等因子释放或参与PI3K/Akt信号通路促进破骨细胞产生和成熟，从而致骨质疏松[18-19]。MDA可反映体内过氧化程度，Zhao等[20]发现氧化应激与绝经后骨质疏松有关，骨质疏松组的MDA水平要高于非骨质疏松组。高脂饮食可通过影响IL-6和TNF-α等氧化应激和炎症因子水平而影响骨骼健康[21]。本实验发现，高脂饲料组与正常饲料组相比，小鼠血清IL-6、TNF-α和MDA水平均升高，破骨细胞数目也明显增加，且在12月龄高脂饲料组中最高。以上结果均提示高脂饲料和高龄均可损害骨健康，且同时存在时损害作用更大。

本研究通过比较正常和高脂饲料喂养不同月龄小鼠后其骨骼系统的健康水平，来探究高脂饲料对不同月龄小鼠骨骼的影响。研究结果表明，高脂饲料会使小鼠血脂水平升高，炎症因子表达上调，对骨健康产生负作用，且该负作用与年龄有关，即高脂和高龄同时存在时对骨骼健康的负作用更加显著。