组蛋白去乙酰化酶4在大鼠骨关节炎软骨退变中的变化趋势及作用

顾晓东 李鹏翠 李飞

1.山西白求恩医院骨科，山西 太原 030032 2.山西医科大学第二医院，骨与软组织损伤修复山西省重点实验室，山西 太原 030001

骨关节炎(osteoarthritis，OA)是中老年人常见的关节疾病，因关节疼痛和功能障碍，严重影响患者的日常生活[1]。关节软骨退行性变是OA最显著的病理特征，随着病变的进展，会继发出现关节周围骨质增生，关节畸形，最终导致关节疼痛及功能丧失[2-3]。虽然在不断地进行研究，但是关节软骨退变的机制不清楚，目前尚未有有效的方法延缓或者逆转关节软骨退变的发生。近年来，有研究发现，OA人群肥大化软骨细胞在关节软骨中的占比增高，这种细胞会大量分泌蛋白酶降解基质，最终破坏软骨，引起严重关节功能障碍[4]。

组蛋白去乙酰化酶4(HDAC4)是调控软骨细胞发生肥大样表型变化的关键酶类，其可以抑制Runx-2的表达，进而抑制软骨细胞发生肥大样改变[5-6]。研究表明，OA患者关节软骨组织HDAC4的含量较正常软骨组织明显降低[7]。然而其在OA发生发展过程中的变化趋势和与关节软骨损伤程度之间的关系并不清楚。本研究拟通过构建大鼠膝关节OA模型，研究OA发生发展过程中HDAC4及其下游分子Runx-2的变化规律及其与关节软骨退变的关系。

1 材料与方法

1.1 实验动物

54只8周龄雄性SD大鼠，购自山西医科大学动物部，实验通过了伦理审查，并且符合相关部门关于实验动物管理和使用规定。

1.2 主要试剂及仪器

Ⅱ型胶原酶及番红染色剂购自美国Sigma公司；IL-1β购自PeproTech公司；HDAC4一抗购自美国Proteintech公司；Runx-2一抗购自北京博奥森公司；免疫组化试剂购自北京中杉金桥公司；TRIzol试剂购自Invitrogen公司；逆转录、PCR试剂购自日本TAKARA公司；荧光定量PCR引物由上海生工公司合成。

1.3 软骨细胞分离培养

出生3 d内的SD大鼠乳鼠，脱颈处死，75%乙醇浸泡消毒。分离乳鼠胸廓组织，PBS清洗3次，加入0.2%的Ⅱ型胶原酶，37 ℃消化90 min，更换0.05% Ⅱ型胶原酶，37 ℃消化3 h，过滤并收集消化液，低速离心10 min，沉淀为软骨细胞团，PBS漂洗及离心后，用含10%的胎牛血清的培养基吹打混匀，按照105个/cm2接种，37 ℃，5% CO2培养箱培养[8]。

1.4 体外OA模型

第2代软骨细胞分为实验组和对照组，细胞生长至60%～70%时，实验组加入IL-1β，使其在培养液中的浓度为10 ng/mL，对照组加等体积无菌PBS缓冲液，48 h后行Western blot检测HDAC4和Runx-2的表达。

1.5 Western blot检测

提取细胞全蛋白，SDS-PAGE电泳分离蛋白，转膜，室温封闭2 h。添加HDAC4(1∶500)、Runx-2(1∶500)抗体，4 ℃过夜。TBST洗膜，然后加入稀释的二抗(1∶5 000)，室温孵育1 h。再次用TBST洗膜，超敏ECL显色并摄取图像。Image Lab软件分析条带灰度值，β-actin为内参，计算蛋白相对表达量。

1.6 实验动物分组与手术

54只8周龄雄性SD大鼠，随机分为假手术组(n=27)和前交叉韧带切断(ACLT)组(n=27)。手术简述：大鼠腹腔注射0.3%戊巴比妥钠 (1 mL/100 g)麻醉。右膝消毒后铺无菌单。切开皮肤，采用髌内切口，切开关节腔，采用11号尖刀片切断ACL，抽屉试验阳性代表手术成功。假手术组只切开关节囊。

1.7 动物取材

术后2、4、8周两组各取9只大鼠过量麻药安乐处死，取右膝关节，胫骨平台做番红固绿及免疫组化检测，股骨髁软骨用于RT-qPCR实验[8]。

1.8 番红固绿染色及OARSI评分

大鼠胫骨平台通过4%多聚甲醛常温固定，10% EDTA脱钙6周，制备6 μm组织切片。脱蜡至水，苏木素染色1 min，流水清洗后盐酸酒精分化15 s，再次清洗2 min。0.05%固绿染色5 min，1%乙酸酸化。蒸馏水清洗后，0.5%番红O染色2 min。脱水透明，封片。关节软骨损伤程度采用OARSI评分[9]。

1.9 免疫组织化学染色

制备大鼠胫骨平台6 μm组织切片，脱蜡至水，3% H2O2使内源性过氧化物酶失活，加入酶消化液行抗原修复，滴加HDAC4(1∶50)、Runx-2(1∶50)抗体，37 ℃孵育120 min；PBS冲洗后加入羊抗兔IgG聚合物，37 ℃孵育30 min；DAB显色，苏木素复染。

1.10 RT-qPCR检测

将大鼠股骨髁软骨用刀片切下，每3只大鼠股骨髁软骨混合成一份样本，共3份样本。TRIzol试剂提取关节软骨中的总RNA，然后逆转录为cDNA。在QuantStudioTM6 Flex Real-Time PCR仪，使用TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ进行两步法RT-qPCR反应。基因的相对表达量采用2-ΔΔCt方法进行计算。引物序列：18SrRNAF: GATGCGGCGGCGTTATT CCC ，R: GTGGTGCCCTTCCGTCAATTCC；HDAC4 F: GGCTTCCTTGTGGTGGTGTTGG ，R: TGTACTCTCCT CGGCATGGTGTC；Runx-2 F: AACAGCAGCAGCAG CAGCAG ，R: GCACGGAGCACAGGAAGTTGG。

1.11 统计学分析

2 结果

2.1 体外OA模型HDAC4和Runx-2的蛋白表达量

Western blot表明，实验组(IL-1β组)细胞HDAC4的表达量较对照组细胞降低(P<0.05)，而Runx-2的表达量较对照组升高(P<0.05)(图1)。

图1 各组细胞HDAC4和Runx-2蛋白表达情况Fig.1 Protein expression of HDAC4 and Runx-2 in each group注：和对照组比较，*P<0.05。

2.2 不同时间点大鼠关节软骨番红固绿染色及OARSI评分

番红固绿染色结果表明，前交叉韧带切断组胫骨平台软骨在2周时可见软骨表面尚平整，未见明显关节软骨破坏，但软骨表面开始纤维化，软骨表层番红着色浅；4周时软骨表面开始出现裂隙，番红着色进一步减少，8周时软骨表层破坏明显，裂隙延伸到软骨中层，部分区域软骨细胞呈簇状增生，番红染色明显减少。各时间点假手术组的软骨表面完整，番红着色均匀。OARSI评分结果显示，与假手术组相比，前交叉韧带切断组各时间点评分均升高(P<0.05)。各时间点假手术组评分差异不明显；前交叉韧带切断组评分随时间延长升高(P<0.05)(图2)。

图2 假手术组和前交叉韧带切断组不同时间点番红固绿染色及OARSI评分结果(×100，标尺：100 μm)Fig.2 Safranin O/Fast green staining and OARSI scores at different time points in Sham and anterior cruciate ligament transection group (×100, scale bar: 100 μ m)注：和假手术组比较，*P<0.05；和2周ACLT组比较，#P<0.05；和4周ACLT组比较，&P<0.05。

2.3 大鼠关节软骨HDAC4和Runx-2免疫组织化学染色结果

免疫组化结果显示，前交叉韧带切断组胫骨平台软骨HDAC4阳性染色细胞随着造模时间延长，其数量逐渐降低，而Runx-2阳性染色细胞数随着造模时间的延长，其数量逐渐增加，各时间点差异明显(P<0.05)。假手术组作为对照组，虽然HDAC4的表达随时间推移有所降低，Runx-2的表达随着造模时间延长有所增加(P<0.05)，但不如前交叉韧带切断组明显(图3、4)。

图3 各组不同时间点HDAC4免疫组化染色结果(×200)Fig.3 Immunohistochemical staining of HDAC4 at different time points in each group (×200)注：和假手术组比较，*P<0.05；和2周ACLT组比较，#P<0.05；和4周ACLT组比较，&P<0.05；和2周假手术组比较，^P<0.05；和4周假手术组比较，%P<0.05。

图4 各组不同时间点Runx-2免疫组化染色结果(×200)Fig.4 Immunohistochemical staining of Runx-2 at different time points in each group (×200)注：和假手术组比较，*P<0.05；和2周ACLT组比较，#P<0.05；和4周ACLT组比较，&P<0.05；和2周假手术组比较，^P<0.05；和4周假手术组比较，%P<0.05。

2.4 大鼠关节软骨HDAC4、Runx-2 mRNA表达量

RT-qPCR结果显示，在相同时间点内，ACLT组HDAC4的表达较假手术组降低，Runx-2的表达升高，差异有统计学意义(P<0.05)。组内比较，ACLT组HDAC4的表达随时间推移逐渐降低，Runx-2的表达升高，差异有统计学意义(P<0.05)。假手术组HDAC4、Runx-2的表达随时间推移虽有差异，但没有ACLT组明显(图5)。

图5 各组不同时间点HDAC4和Runx-2 mRNA的表达比较Fig.5 Comparison of HDAC4 and Runx-2 mRNA expression at different time points between each group注：和假手术组比较，*P<0.05；和2周ACLT组比较，#P<0.05；和4周ACLT组比较，&P<0.05；和2周假手术组比较，^P<0.05；和4周假手术组比较，%P<0.05。

3 讨论

软骨细胞是关节软骨中仅有的细胞种类，其散在分布于关节软骨基质中，软骨细胞在维持软骨的正常合成和降解代谢中十分关键[10]。软骨细胞表型及其功能的改变会破坏软骨的代谢稳定性，从而破坏软骨正常的生物力学性能，最终导致关节软骨损伤。在OA病变软骨进行性退变破坏过程中，软骨细胞发生了肥大样改变。肥大的软骨细胞表达Runx-2、MMP-13等因子水平升高，导致软骨破坏[11-12]。其中，Runx-2在调控细胞肥大表型中起关键作用[13]。Runx-2可以促进其下游MMP-13、ADAMTS5等软骨基质降解酶类的表达，破坏软骨基质，从而促进骨关节炎的进展[14]。在小鼠膝关节不稳定OA模型中，通过条件性敲除软骨细胞Runx-2基因，其下游MMP-9、13和ADAMTS4、5、7、12的表达降低，从而延缓OA关节软骨退变。另外，Runx-2对成骨细胞分化起到关键作用[15]，因此在OA进程中，Runx-2的变化同样会影响软骨下骨的改变。由于关节软骨与软骨下骨之间可能存在密切的关系和相互作用，因此，将小鼠软骨中的Runx2敲除，这种小鼠不但软骨降解受到抑制，软骨下骨硬化亦得到好转[16]。

HDAC4是Runx-2的上游分子，它可以与Runx-2启动子结合，抑制其转录，使其在细胞内的表达下调，从而起到抑制软骨细胞发生肥大表型改变的作用[8]。提高细胞中HDAC4的表达水平，可起到与Runx-2敲除相同的抑制软骨细胞肥大化及后续的软骨内成骨的效果[17]。HDAC4敲基因鼠由于丧失了其抑制Runx-2的作用，促进了软骨细胞肥大样改变的进程，从而导致小鼠骨骼提前发生矿化[5]。另外，HDAC4作为去乙酰化酶，具有去乙酰化的酶活性，由于其特殊的核内外定位序列，其具有核质穿梭的能力，可通过其核质穿梭机制，使Runx-2发生去乙酰化，从而加速其降解[18]。

本研究通过体外细胞OA模型及大鼠前交叉韧带切断体内OA模型，并在造模的不同时间点选取大鼠处死，通过番红染色、免疫组化及PCR等实验方法研究了HDAC4及其下游Runx-2在OA发生发展过程中的变化趋势以及其对软骨退变的影响。从而有助于对这两种软骨细胞肥大相关关键分子在OA中的作用进行深入的了解。本实验中，体外OA模型条件下，HDAC4的表达降低，而Runx-2的表达升高。大鼠前叉切断OA模型结果表明，随着术后时间不断增加，即骨关节炎软骨退变程度的不断加重，HDAC4的表达量持续下降，而Runx-2的表达持续增高。这说明HDAC4的降低和Runx-2的表达升高参与了OA的病理进程，这种变化可能是由于在OA发生发展过程中，HDAC4的表达量不断降低，其对Runx-2的抑制作用持续减弱，导致软骨细胞发生肥大样改变。本研究通过番红固绿染色评价了OA发生和进展过程中蛋白聚糖丢失和软骨破坏情况。结果显示，随着术后时间的增加，番红着色逐渐变浅，且从软骨表面染色浅逐渐过渡到软骨中深层染色浅，从软骨表面粗糙、纤维化进展到软骨裂隙出现，软骨面皲裂，破坏。这表明随着软骨细胞发生肥大样改变，软骨正常的代谢平衡遭到破坏，从而导致OA的不断进展。OARSI是一种半定量评分，定义为OA分级与OA分期相结合的评估，OARSI分数为0～24分，评分越高，代表软骨损伤越严重[9]。在番红固绿染色的基础上，本研究对OA进展过程中软骨损伤的程度进行了评分，研究表明，随着时间推移，OARSI评分逐渐升高，OA关节软骨退变在不断进展。

综上所述，本研究发现，在OA发生和进展过程中，HDAC4含量的不断降低，而其下游Runx-2的表达逐渐增加，导致软骨细胞发生肥大样改变，软骨正常的代谢稳定遭到破坏，导致OA关节软骨退变。本研究的不足之处在于：前交叉韧带切断模型是一种关节不稳定模型，并不能完全模拟OA发生和进展的病理过程，后续将探索更好的动物模型来模拟OA的病理进程，更好地阐明OA的发病机制。另外，后续将进行更详细的细胞实验来验证在OA病理进程中，HDAC4对Runx-2的调控作用，为OA的防治提供理论依据。