miR-155靶向调节PIK3R1对类风湿关节炎大鼠模型PI3K/Akt/mTOR信号通路的影响

吴焘 张国秋 李超 张兰涛

青海大学附属医院关节外科，青海 西宁 810012

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种慢性关节炎性疾病，病理特征以关节组织炎症损伤、软骨组织破损、滑膜增生等为主，患者关节畸形、疼痛、功能受损，导致其行动不便，工作能力丧失，生活质量严重下降[1-2]。RA患者免疫系统功能紊乱，体内氧化应激水平增高，抑制炎症，可减轻足肿胀、水肿等关节炎症状，是防治RA的有效手段[3]。miR-155可抑制TLR4/NF-κB信号激活，抑制炎症，明显改善大鼠临床症状[4]。PI3K/Akt信号可参与介导RA的发生发展过程，阻断其传导，可减少促炎因子产生，阻止炎症反应，抑制滑膜增生，改善RA大鼠关节炎症状[5]，PIK3R1是PI3K/Akt/mTOR信号的负调节因子，脂多糖可下调其表达，促使炎症进展[6-7]，miR-155可靶向下调PIK3R1的表达，进而激活PI3K/Akt信号，促进软骨细胞凋亡[8]，但miR-155靶向调节PIK3R1对RA大鼠PI3K/Akt/mTOR信号通路及关节炎症的影响目前还不清楚，本文通过构建RA大鼠模型，对此进行探究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物：SPF级SD雄性大鼠，成都达硕实验动物有限公司，生产许可证号为SCXK(川)2020-030，动物饲养和实验操作均严格遵循《实验动物管理条例》要求。

1.1.2主要试剂与仪器：牛Ⅱ型胶原(货号1220-02)由艾美捷科技有限公司提供；不完全弗氏佐剂(货号7002)由北京博蕾德生物科技有限公司提供；人胚肾细胞株293 T(CL-0005)、DMEM培养基(PM150210)分别由武汉普诺赛生命科技有限公司和北京索莱宝科技有限公司提供；胎牛血清(30044333)、Opti-MEM培养基(31985062)由美国Thermo Fisher Scientific公司提供；LipofectamineTM2000(11668019)由美国invitrogen公司提供；miR-155 agomir、miR-155 antagomir、miR-155阴性对照、PIK3R1 3′-UTR无义序列、野生型PIK3R1 3′-UTR报告质粒、突变型PIK3R1 3′-UTR报告质粒，由吉凯基因公司提供；miR-155、U6、GAPDH、PIK3R1引物由上海生工生物工程股份有限公司提供；高效RIPA裂解液(货号R0010)、总RNA提取试剂盒(货号R1200)、HE染色试剂盒(货号G1120)、逆转录试剂盒(货号T2240)、大鼠IL-6 ELISA试剂盒(货号SEKR-0005)、大鼠IL-17 ELISA试剂盒(货号SEKR-0007)、大鼠IL-18 ELISA试剂盒(货号SEKR-0054)、BCA蛋白浓度测定试剂盒(货号PC0020)、SYBR Green Realtime PCR Master Mix(货号QPK-201)、胰蛋白酶-EDTA消化液(T1300)、青链霉素混合液(P1400)、双荧光素酶报告基因检测试剂盒(货号D0010)由北京索莱宝科技有限公司提供；兔源Anti-PI3K一抗(货号ab151549)、兔源Anti-GAPDH(货号ab181602)一抗、兔源Anti-p-PI3K一抗(货号ab138364)、兔源Anti-AKT一抗(货号ab179463)、兔源Anti-p-AKT一抗(货号ab38449)、兔源Anti-p-mTOR一抗(货号ab84400)、兔源Anti-mTOR一抗(货号ab2732)、羊抗兔二抗(货号ab150077)由Abcam公司提供等。

YLS-7B足趾容积测量仪由上海鑫闵生命科技有限公司提供(中国)；CX23光学显微镜由Olympus公司提供(日本)；XElx800型酶标仪由Perkin Elmer公司提供(美国)；ABI 7500实时PCR系统由应用生物系统公司提供(美国)；RM2035轮转切片机由莱卡公司提供(德国)；Mini PROTEAN蛋白电泳仪与转膜仪由伯乐公司提供(美国)；GIS-500型凝胶成像仪由杭州米欧仪器有限公司提供(中国)等。

1.2 方法

1.2.1建立RA大鼠模型及分组处理：参照文献[9]诱导建立RA模型大鼠：将牛Ⅱ型胶原蛋白与不完全弗氏佐剂等体积混合，匀浆搅拌(30 000 r/min，2.5 min)，制成乳剂，于大鼠尾部皮下注射200 μL，1周后再次注射200 μL，3 d后即完成造模，造模成功率87.3%，死亡7只，将其随机分为模型组、miR-155 agomir组、miR-155 antagomir组、miR-155阴性对照组，每组均12只，另取12只大鼠以同样方法注射等剂量0.9% NaCL溶液，作为对照组。

参照文献[10]及说明书，将miR-155 agomir、miR-155 antagomir、miR-155阴性对照溶于0.9% NaCL溶液，以100 μg/g的剂量分组尾静脉注射，模型组、对照组大鼠尾静脉注射等剂量0.9% NaCL溶液，隔日注射一次，共注射3次。

1.2.2大鼠关节炎指数评分及后足趾容积测定：给药干预结束后24 h，观察大鼠双侧后足关节症状进行评分，标准如下[11]：关节无肿胀，形态正常，0分；关节轻微肿胀，1分；关节中度肿胀，2分；关节严重肿胀，3分；关节严重肿胀并出现运动障碍，4分。然后以足趾容积测量仪测量大鼠后足趾容积，每只大鼠测量3次，取平均值。

1.2.3大鼠关节组织病理形态检测及标本采集：以乙醚气体麻醉大鼠，然后颈椎脱臼处死，解剖取出双侧后足关节，每只大鼠剪下两块关节组织，均约0.8 g，分组标记后保存在液氮中。剩余关节组织漂洗、脱水、透明、包埋后切片，然后选出厚薄均匀且无破损的关节组织切片，脱蜡、水化、HE染色(步骤参照试剂盒说明书)、漂洗、脱水、透明、封片，使用显微镜观察大鼠关节组织病理形态，并选出任意5个视野进行拍照。

1.2.4大鼠关节组织炎性因子IL-6、IL-17及IL-18水平检测：取出1.2.3中保存在液氮中的关节组织0.8 g，研碎后，加入高效RIPA裂解液，冰水浴中匀浆，4 ℃离心后取出上清，通过BCA法测出各组蛋白总浓度后检测IL-6、IL-17及IL-18水平(步骤参照各自试剂盒说明书)，剩余关节组织蛋白样品液保存在-80 ℃，进行蛋白表达检测。

1.2.5大鼠关节组织PI3K/Akt/mTOR信号通路蛋白表达水平测定：取1.2.4中剩余的各组关节组织蛋白样品液，加入适量上样缓冲液后煮沸，5 min后蛋白变性后向SDS-PAGE浓缩胶上样孔中加入含20 μg总蛋白的样品液，电泳(110 V，85 min)将蛋白在分离胶中充分分离，湿转(40 mA，75 min)将分离胶中蛋白转移至硝酸纤维膜上，蛋白非特异位点经5%的脱脂奶粉封闭(37.5 ℃，2 h)后，根据分子量截下目的蛋白，经兔源Anti-PI3K一抗、Anti-GAPDH一抗、Anti-p-PI3K一抗、Anti-AKT一抗、Anti-p-AKT一抗、Anti-p-mTOR一抗、Anti-mTOR一抗孵育12 h(4 ℃)，洗膜3次(TBST，37.5 ℃，5 min/次)，羊抗兔二抗孵育1.5 h(37.5 ℃)，洗膜3次(TBST，37.5 ℃，5 min/次)，化学发光法显色，采集蛋白条带图像，运用Image J软件对其灰度值定量，然后统计做分析后得出各组蛋白相对表达量。

1.2.6大鼠关节组织miR-155及PIK3R1 mRNA水平检测：将1.2.3中保存在液氮中的关节组织0.8 g研碎后，提取总RNA后通过逆转录实验制得cDNA(步骤参照各自试剂盒说明书)，取反应排管，向其中依次加入6 μL DEPC水，10 μL SYBR Green Realtime PCR Master Mix，0.4 μL ROX染料，上、下游引物各0.8 μL，混匀后上机做PCR扩增，参照试剂说明指导设定反应参数，所得Ct值采用2-ΔΔCt法计算，以U6做miR-155内参，以GAPDH做PIK3R1内参，引物序列见表1。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 qRT-PCR primer sequences

1.2.7双荧光素酶报告基因实验检测miR-155对PIK3R1的靶向调控：将购买的293 T细胞快速解冻后，以5 mL细胞培养液(DMEM培养基+1%青链霉素混合液+10%胎牛血清)重悬混匀，接种在培养瓶中，无菌培养至细胞基本铺满瓶底，传代后接种在24孔板，无菌培养12 h后随机分为转染PIK3R1 3′-UTR无义序列+miR-155 mimics阴性对照组、转染PIK3R1 3′-UTR无义序列+miR-155 mimics组、转染野生型PIK3R1 3′-UTR报告质粒+miR-155 mimics阴性对照组、转染野生型PIK3R1 3′-UTR报告质粒+miR-155 mimics组、转染突变型PIK3R1 3′-UTR报告质粒+miR-155 mimics阴性对照组、转染突变型PIK3R1 3′-UTR报告质粒+miR-155 mimics组，将细胞培养液更换为Opti-MEM培养基，使用LipofectamineTM2000参照其说明书指导做分组转染6 h，然后弃去Opti-MEM培养基，以细胞培养液继续无菌培养24 h，采用双荧光素酶报告基因检测试剂盒，并参照其说明指导对各组双荧光素酶相对活性进行测定。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 miR-155对大鼠关节炎指数及后足趾容积的影响

与对照组比较，模型组大鼠关节炎指数及后足趾容积明显升高(P<0.05)。与模型组、miR-155阴性对照组分别比较，miR-155 antagomir组大鼠关节炎指数及后足趾容积降低(P<0.05)；miR-155 agomir组大鼠关节炎指数及后足趾容积升高(P<0.05)。见图1。

图1 各组大鼠关节炎指数及后足趾容积Fig.1 Arthritis index and hind toe volume of rats in each group注：与对照组比较，aP<0.05；与模型组相比，bP<0.05；与miR-155阴性对照组相比，cP<0.05。

2.2 miR-155对大鼠关节组织病理形态的影响

对照组大鼠关节形态结构正常，组织无损伤。模型组大鼠关节表面不平整，滑膜层增厚，软骨侵蚀破坏，有大量炎性细胞浸润，关节组织呈现较严重病理损伤。与模型组、miR-155阴性对照组分别比较，miR-155 antagomir组大鼠关节组织病理损伤减轻；miR-155 agomir组大鼠关节组织病理损伤加重。见图2。

图2 HE染色观察各组大鼠关节组织病理形态(×200)Fig.2 HE staining was used to observe the pathological morphology of joints in each group(×200)

2.3 miR-155对大鼠关节组织炎性因子IL-6、IL-17、IL-18水平的影响

与对照组比较，模型组大鼠关节组织炎性因子IL-6、IL-17、IL-18水平明显升高(P<0.05)。与模型组、miR-155阴性对照组分别比较，miR-155 antagomir组大鼠关节组织炎性因子IL-6、IL-17、IL-18水平降低(P<0.05)；miR-155 agomir组大鼠关节组织炎性因子IL-6、IL-17、IL-18水平升高(P<0.05)。见图3。

图3 各组大鼠关节组织炎性因子IL-6、IL-17、IL-18水平Fig.3 Levels of inflammatory factors IL-6, IL-17, and IL-18 in joint tissue of rats in each group注：与对照组比较，aP<0.05；与模型组相比，bP<0.05；与miR-155阴性对照组相比，cP<0.05。

2.4 miR-155对大鼠关节组织PI3K/Akt/mTOR信号通路蛋白表达的影响

与对照组比较，模型组大鼠关节组织PI3K/Akt/mTOR信号通路蛋白p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR水平均明显升高(P<0.05)。与模型组、miR-155阴性对照组分别比较，miR-155 antagomir组大鼠关节组织PI3K/Akt/mTOR信号通路蛋白p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR均降低(P<0.05)；miR-155 agomir组大鼠关节组织PI3K/Akt/mTOR信号通路蛋白p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR水平均升高(P<0.05)。见图4、5。

图4 免疫印迹实验检测大鼠关节组织PI3K/Akt/mTOR通路蛋白表达Fig.4 The expression of PI3K/Akt/mTOR pathway proteins in the joint tissue of rats was detected with Western blotting注：A：对照组；B：模型组；C：miR-155 antagomir组；D：miR-155 agomir组；E：miR-155阴性对照组。

图5 各组大鼠关节组织PI3K/Akt/mTOR信号通路蛋白相对表达水平Fig.5 Relative expression level of PI3K/Akt/mTOR signal pathway proteins in the joint tissue of rats in each group注：与对照组比较，aP<0.05；与模型组相比，bP<0.05；与miR-155阴性对照组相比，cP<0.05。

2.5 miR-155对大鼠关节组织miR-155及PIK3R1 mRNA水平的影响

与对照组比较，模型组大鼠关节组织miR-155水平明显升高(P<0.05)，PIK3R1 mRNA水平明显降低(P<0.05)。与模型组、miR-155阴性对照组分别比较，miR-155 antagomir组大鼠关节组织miR-155水平降低(P<0.05)，PIK3R1 mRNA水平升高(P<0.05)；miR-155 agomir组大鼠关节组织miR-155水平升高(P<0.05)，PIK3R1 mRNA水平降低(P<0.05)。见图6。

图6 各组大鼠关节组织miR-155及PIK3R1 mRNA水平Fig.6 MiR-155 and PIK3R1 mRNA levels in the joint tissues of rats in each group注：与对照组比较，aP<0.05；与模型组相比，bP<0.05；与miR-155阴性对照组相比，cP<0.05。

2.6 miR-155对PIK3R1的靶向调节

经miRcode数据库预测miR-155和PIK3R1之间有结合位点，推测PIK3R1可能是miR-155的靶基因。与转染PIK3R1 3′-UTR无义序列+miR-155 mimics阴性对照组(0.99±0.15)比较，转染PIK3R1 3′-UTR无义序列+miR-155 mimics组(1.02±0.13)相对荧光素酶活性无明显差异(P>0.05)。与转染野生型PIK3R1 3′-UTR报告质粒+miR-155 mimics阴性对照组(1.00±0.18)比较，转染野生型PIK3R1 3′-UTR报告质粒+miR-155 mimics组(0.31±0.09)相对荧光素酶活性显著降低(P<0.05)；与转染突变型PIK3R1 3′-UTR报告质粒+miR-155 mimics阴性对照组(0.99±0.16)比较，转染突变型PIK3R1 3′-UTR报告质粒+miR-155 mimics组(1.01±0.25)相对荧光素酶活性无明显差异(P>0.05)。见图7。

图7 miRcode数据库预测miR-155和PIK3R1之间的结合位点Fig.7 miRcode database predicts the binding site between miR-155 and PIK3R1

3 讨论

依据文献方法[9]诱导RA模型，引发炎症反应，导致关节肿胀发炎，模型建立成功。研究发现，RA患者体内长期存在炎症，抑制致炎细胞因子表达及释放，减轻炎症是RA治疗的关键[12]。miR-155是介导炎症反应的重要因子，脂多糖可促使其表达，引发炎症并促进其进展；下调miR-155表达，可抑制脂多糖诱导的软骨细胞炎症，降低其凋亡率，改善骨关节炎症状[13]，本文显示miR-155 antagomir可降低关节组织miR-155水平，减轻关节组织病理损伤，降低关节炎指数、后足趾容积、关节组织炎性因子IL-6、IL-17及IL-18水平，miR-155 agomir起到相反的作用，表明miR-155参与介导RA的发病与病情进展过程；下调其表达，可减少促炎细胞因子产生，抑制关节炎症，减轻关节组织损伤，改善关节肿胀等症状。

PI3K/Akt/mTOR可介导关节炎疾病，阻断PI3K/Akt信号途径，可改善膝骨关节炎大鼠软骨损伤，减轻大鼠关节炎症[14]，PIK3R1可负调控PI3K/Akt的激活，抑制PI3KR1表达，增强PI3K、Akt的磷酸化[15]，miR-155可增强PI3K/Akt信号，并靶向下调PIK3R1表达，在白细胞介素-1β诱导的原代软骨细胞中，miR-155可通过靶向下调PIK3R1激活PI3K/Akt通路，引发软骨细胞凋亡和分解[16]，本文显示RA大鼠关节组织PIK3R1 mRNA水平明显降低，p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt及p-mTOR/mTOR水平明显升高，以拮抗剂antagomir下调miR-155表达，可升高PIK3R1 mRNA水平，抑制PI3K/Akt/mTOR信号激活，miR-155 agomir作用相反。此外，还显示miR-155能靶向下调PIK3R1的表达，表明miR-155可靶向下调PIK3R1的表达，激活PI3K/Akt/mTOR信号，促进RA病情进展，下调其表达，可增强PIK3R1的表达，阻断PI3K/Akt/mTOR信号传导，抑制炎症，减轻关节组织损伤，改善RA大鼠关节炎症状。

综上所述，miR-155在RA大鼠中高表达，下调其表达，可上调PIK3R1表达，抑制PI3K/Akt/mTOR信号激活，阻止炎症反应发生发展，减轻关节组织损伤，改善RA大鼠关节肿胀等症状，证实靶向PIK3R1调控PI3K/Akt/mTOR信号表达是调节RA大鼠病情的作用机制之一，是否有其他通路间接参与调控RA大鼠病情，还有待进一步实验加以说明。