肌少-骨质疏松症动物模型及评价方法研究进展

郑浩 姚啸生 路翀 杜一峰 叶嘉杰 于红卫

1.辽宁中医药大学，辽宁 沈阳 110847 2.辽宁中医药大学附属医院，辽宁 沈阳 110032

肌少-骨质疏松症(osteo-sarcopenia，OS)是肌少症(sarcopenia，SP)与骨质疏松症(osteoporosis，OP)协同致病的结果[1]。随着社会人口老龄化的程度日益加剧，OS的发病率也在逐年上涨[2]。一项研究征集了2 353名社区老年人，发现60～64岁的男性OS发病率为14.3%，而女性OS的发病率高达20.3%[3]。其中SP是以年龄相关的肌肉质量损失、肌肉力量降低和(或)机体活动性功能减退为主要特征的退行性疾病[4]；OP属于全身性骨病范畴，以骨量降低、骨的微观结构退化以及骨的脆性增加为主要特征[5]。当两者协同致病时，一定程度上增加了老年人跌倒的风险，导致脆性骨折的发病率大幅上升[6]，严重影响了老年人的健康并给社会医疗带来巨大负担[7-8]。

为了深入研究OS的病理机制并研制有效的临床药物，构建切实有效的OS实验动物模型至关重要。本文以鼠为主要模型动物，介绍衰老OS模型、去势OS模型、化学诱导OS模型、废用OS模型以及基因OS模型的研究进展，对不同造模方式的优缺点和适用范围进行综述，并简述OS模型的评价指标。

1 动物模型

1.1 衰老OS模型

衰老是大多数肌骨疾病的主要危险因素，因此衰老模型被广泛应用于OS的研究中[9]。大鼠的预期寿命约为24个月，对比大鼠与人脑衰老过程中铜通量的改变，推算出18～24月龄的大鼠相当于56～69岁的人类[10]。Kim等[11]研究发现18月龄C57BL/6J鼠的骨骼肌质量、骨骼肌力量以及运动能力均明显低于10周龄的鼠，提示18月龄的C57BL/6J鼠可能存在SP。在Zhu等[12]的研究中，15月龄雌性SD大鼠的腰椎和双侧股骨骨密度(bone mineral density，BMD)以及骨矿含量明显低于3月龄大鼠，提示15月龄的大鼠符合OP自然衰老模型。因此推测构建OS自然衰老模型可以选用18月龄鼠。除了月龄，大鼠的性别对衰老模型也有一定的影响，由于雄鼠比雌鼠寿命更长，且雌鼠会分泌大量雌激素，不利于模型的建构，因此大多数研究倾向于选择雄鼠进行造模[13]。

由于自然衰老模型建模周期较长，为了缩短衰老OS的建模时间，研究人员给予大鼠高脂饮食，因为高脂饮食是一种公认的衰老加速器[14]。Hu等[15]研究发现，高脂饮食模型鼠肌细胞的再生能力和分化能力严重受损。不仅如此，高脂饮食带来的肥胖还会增加炎症细胞因子[16]以及降低脂联素的表达水平[17]，从而导致BMD下降[16-17]，因此高脂饮食能加速构建衰老OS模型的。除外高脂饮食还可以选用衰老加速易感鼠(senescence accelerated mouse/ prone，SAMP)进行造模，Azuma等[18]研究发现SAMP6鼠骨小梁形成明显减少，而骨髓中脂肪含量明显增多，是理想的加速衰老OP模型。Guo等[19]深入研究还发现8月龄的SAMP8鼠处于SP早期，而10月龄的SAMP8鼠则已经处于SP阶段。因此可以配合高脂饮食或选用SAMP鼠建构加速衰老的OS模型。

1.2 去势OS模型

去势作为目前较为公认的OP造模方式，其起源可追溯到1969年，Saville等[20]通过手术摘除大鼠双侧卵巢(OVX)，随后发现大鼠表现出明显的骨质疏松症状。深入研究发现雌性SD大鼠去势后，体内雌二醇(E2)水平明显下降，导致促卵泡素以及促黄体生成素的分泌量上升，从而影响骨代谢，破骨大于成骨，骨量下降最终发展为OP[21]。Wang等[22]以及Wen等[23]的研究也解释了其中的原理，研究发现去势大鼠体内miR125b水平上升，过表达的miR125b能通过miR-125b-TRAF6通路促进骨质疏松[22]。除此之外去势还会影响肠道菌群，并通过“菌群-肠道-代谢-骨”影响骨代谢，导致OP[23]。

去势导致的低E2状态还在一定程度上降低鼠骨骼肌的质量和力量，Karvinen等[24]在OVX术后6周处死模型鼠，从腓肠肌中分离出RNA，分析发现E2的下降影响了凋亡相关的microRNAs，导致肌细胞凋亡增加，骨骼肌质量下降，最终模型鼠出现SP。Ezzat-Zadeh等[25]将10月龄的SD雌性大鼠去势后继续饲养5个月，随后进行大鼠的运动能力、肌骨形态学以及血清检测，发现模型鼠活动量显著减少、骨量下降9.6%，骨骼肌质量与体重比下降10.5%，结合血清指标提示OVX术后6周的SD雌性鼠同时存在骨质疏松和骨骼肌萎缩，即成功构建了OS模型。

1.3 化学诱导OS模型

化学诱导法是通过将诱导肌骨退变的物质直接注射或灌入模型体内从而诱发OS。构建化学诱导模型最常用化学物质的是糖皮质激素(Glucocorticoid，GC)，研究发现长期应用GC会带来肌肉萎缩[26]、皮质骨和小梁骨强度降低等副作用[27-28]。深入研究发现长期应用GC能通过影响肠道菌群[29]以及氧化应激反应[30]导致骨丢失。同时Massaccesi等[31]以及Nakashima等[32]研究发现长期使用地塞米松(DXM)会上调O-GlcNAcylation[31]以及atrogin-1/MAFbx[32]的表达水平，导致肌肉萎缩。

在Aru等[334]的研究中，雌性Wistar大鼠在连续注射DXM后，出现大鼠体重和瘦体重下降，同时后肢抓力下降了25%，认为成功构建了SP模型。Yang等[34]给8周龄的雄性Sprague-Dawley大鼠以1 mg/kg的剂量注射DXM每周2次。12周后进行双侧股骨和第5腰椎BMD、micro-CT以及骨生物力学检查，同时检测骨转化指标，发现DXM化学诱导后大鼠的BMD、骨微观结构和骨生物力学指标均显著下降，提示OP模型构建成功。而在Pal等[35]的研究中，大鼠连续4周每天皮下注射5 mg/kg的甲基强的松龙(MP)，通过micro-CT、骨强度以及肌骨形态学等检测结果判定OS模型构建成功。

1.4 废用OS模型

废用模型有多种不同的构建方式，例如后肢悬吊/卸载(HLS/HLU)、脊髓损伤(SCI)、注射肉毒杆菌毒素(BTX)以及石膏绷带固定等[36]。Mankhong等[37]的研究表明HLS能通过破坏诱导氧化失衡、线粒体功能障碍、炎症反应以及蛋白平衡失衡等多种方式诱导肌肉萎缩，并且HLS已被证实可以模拟临床SP患者[38]。研究发现，在废用模型中骨骼受到的机械负荷明显减少，导致骨量迅速丧失[39]。Peres-Ueno等[40]的研究结果证明了这一观点，将26月龄的雌性Wistar大鼠实施HLU，3周后发现HLU大鼠股骨BMD明显下降，骨微结构严重恶化。因此，HLS/HLU能成功构建OS模型。

Brent等[41]将4 IU的BTX注射到12～14周龄雌性Wistar大鼠右后肢骨骼肌中，6周后通过双能X线吸收法(DXA)、μCT、力学测试以及肌骨形态学检测，发现废用模型的肌肉质量下降63%，骨体积分数(BV/TV)下降28%，骨小梁厚度(Tb.Th)减小11%，骨干皮质厚度降低10%，股骨远端干骺端骨强度降低27%，提示BTX成功构建了OS模型。在Yarrow等[42]的研究中，使用14周龄的雄性大鼠制造SCI模型，在损伤后21 d，发现SCI大鼠的骨小梁数量减少70%，Tb.Th减少13%～27%，小梁分离增加，除此之外还发现SCI大鼠小腿三头肌肌量减少35%，提示SCI能成功构建OS模型。

1.5 基因OS模型

基因模型的造模方式主要有转基因造模法和基因突变造模法，其中转基因造模法多是指采用基因敲除的方式来构建动物模型。研究表明慢性炎症是导致SP重要病机之一，Ko等[43]研究现IL-10缺失模型鼠骨骼肌中的三磷酸腺苷合成率下降，线粒体功能明显受损，除此之外，IL-10基因的纯合子缺失在一定程度上会促进NF-κB炎症介质的表达。因此该模型可以模拟人身体炎症、肌肉无力以及整体活动降低的状态[43]。另一种常用的基因敲除模型是铜锌超氧化物歧化酶(SOD1)敲除鼠，Sataranatarajan等[44]研究发现SOD1缺失的模型鼠在5月龄时就表现出多种SP的典型表型。而在使用基因敲出制造OP模型时多选择敲除雌激素受体α/β或芳香酶，研究表明这种模型具有全身骨质疏松且不受外界因素干预等特性[45]。除此之外，研究表明目前至少有100多种目的基因与OP存在密切联系，例如OPG、RANKL、RUNX2以及VEGF等[46]。

2 不同造模方式的特点及应用范围

5种造模方式均可以成功构建OS动物模型，不同的建模方法均有着各自的优缺点和适用范围，应当根据实验的目的、方向、设备以及时间等因素选用最佳的造模方式[47]。

(1)自然衰老模型能最大程度地反映衰老的过程，该模型适用于正常衰老相关OS的研究，但该模型需要花费大量时间构建，花费大量人力及时间成本。为了解决自然衰老模型建模时间长的问题，研究人员使用高脂饮食加速模型衰老，但是该模型伴随体脂增高，是老年肥胖OS的理想模型，但不适用于瘦体质老年OS。另一种加速衰老的SAMP模型无法体现衰老引起的OS，但因其建模周期短，可用于研究各种干预措施对OS的影响。(2)去势模型的特征是能模拟雌激素缺失引起的肌骨退变，因此是女性绝经后OS的理想模型，无法模拟老年男性OS，除此之外，去势手术需要操作人员具备一定的外科手术技术，且麻醉及手术过程对动物都是不可忽视的损伤。(3)临床上存在一部分人群需要长期大量应用激素等化学物质，其患OS的概率高于正常人，研究这类人群的OS需要应用化学诱导模型。化学诱导模型的缺点在于化学药物的种类多，且用法用量缺乏统一的标准。(4)在废用模型中，HLS构建的模型是一种与运动无关的OS模型，能模拟术后长期卧床引起OS，但是HLS操作较为复杂，并且需要定期检验制动是否失效；使用BTX构建模型，造模时间短，但存在模型致死的风险；SCI建构的OS模型能很好地模拟脊髓损伤患者的OS，其缺点在于应用范围有限。(5)基因模型能较快地建立OS模型，并且其靶向性明确，其缺点是没有正常衰老的特征，除此之外，基因模型一次只能有一两个基因被敲除，难以探究基因之间的相互作用。

除此之外，还有研究人员将两种造模方式结合使用，例如去势结合糖皮质激素构建OS模型[48]，这种模型肌肉萎缩以及骨质疏松的程度更高，虽然对应临床上这样的患者数量较少，但是可以应用于严重OS的研究。

3 OS模型的评价方法

3.1 骨骼肌相关评价方法

骨骼肌相关指标主要围绕着骨骼肌的力量、骨骼肌的质量以及骨骼肌的功能3个方面展开。其中骨骼肌力量可应用抓力测定仪通过测量鼠前肢或四肢抓力判断[49]；骨骼肌质量则可以通过CT、MRI、DXA或生物电阻抗分析，其中CT和MRI可以最直接、最准确地测量肌肉质量[50]；骨骼肌功能则可以通过旋转器试验[51]或水迷宫实验[52]反应。除此之外，骨骼肌的微观形态也是重要观测指标。

3.2 骨相关评价方法

骨相关评价指标主要有BMD、骨生物力学、骨形态和骨转化指标。其中BMD是诊断OP的关键指标，测量BMD的最常用方法是DXA[53]，而micro-CT也是常用的BMD测量方法，并且micro-CT还能观察骨的微观结构形态[54]；骨生物力学可以判断骨的强度、硬度和韧性，多通过三点弯曲实验、旋转实验以及疲劳实验等方法测量；骨转化指标则是通过测量血钙、血磷、成骨指标以及破骨标志来判断骨代谢水平。

4 小结

OS病理机制的核心是骨骼肌与骨的退变，现代研究发现骨骼肌与骨组织在生物力学以及内分泌等多个方面存在密切联系，例如骨骼肌分泌的肌抑素、鸢尾素等肌动因子，不仅能调节骨骼肌生长，还在一定程度上影响骨代谢[55]。而中医学“骨肉不相亲”理论中也有“故骨髓不濡，即肉不着骨，骨肉不相亲，即肉濡而却，肉濡而却……骨先死”的论述，深刻地阐释了肌骨退变之间的联系。提示骨骼肌与骨的退变多协同发生，这是文中5种造模方式能成功构建OS模型的理论基础。但OS属于进展性的长病程疾病，现阶段的动物模型多侧重于表现OS的某种病因或某一阶段的病理改变，不能完全体现人类患OS的病理变化过程。并且不同的造模方式都有着各自的优缺点，在设计实验时，需对应OS的不同病因以及病理阶段，选择最适合的造模方式。今后的研究将着眼于如何攻克各造模方式的缺点，使OS模型的设计更佳符合相似性、可靠性、重复性、适用性、可控性、易行性和经济性的造模原则，为深入探究OS并研制有效临床药物做出贡献。