2型糖尿病患者血清semaphorin3A水平与骨密度及骨代谢指标的相关性分析

陈镜 冯正平

重庆医科大学附属第一医院内分泌科，重庆 400016

2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)和骨质疏松症是常见的慢性疾病，其患病率逐年上升。目前我国的糖尿病患病率高达11.2%，50岁以上人群骨质疏松患病率高达19.2%。2型糖尿病患者因为持续高血糖状态、胰岛素相对或绝对缺乏、糖尿病微血管病变及体内激素水平的改变等原因，其患骨质疏松及骨质疏松性骨折的风险明显升高[1]。信号素3A(semaphorin3A，Sema3A)作为信号素家族中的一员，是胚胎发育、肿瘤发生、免疫调节及骨发育的重要调节因子[2-3]。在骨重建过程中，Sema3A通过抑制骨吸收和促进骨形成发挥骨保护作用[4-5]。动物研究[6]表明高糖可降低Sema3A及其受体神经纤毛蛋白-1(neuropilin-1，Nrp1)的表达，并且降低成骨相关基因的表达，从而抑制成骨分化。有关糖尿病患者血清Sema3A水平与骨代谢的相关性尚无报道。本研究旨在观察2型糖尿病患者血清Sema3A水平与骨密度、骨代谢指标的相关性，为临床防治糖尿病合并骨质疏松提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 研究对象

选取2020年3月至2021年1月于重医附一院内分泌科住院的2型糖尿病患者共129例。根据DXA测定的腰椎(L1～L4)或股骨颈或全髋骨密度，按T值分成骨质疏松组(62例，T值≤-2.5)和非骨质疏松组(67例，T值>-2.5)，其中非骨质疏松组包括低骨量和正常骨量患者。该研究通过医院伦理委员会批准，由于ELISA检测标本来自内分泌实验室废弃血标本，故免除知情同意。

1.1.1纳入标准：①根据1999年WHO的糖尿病诊断标准诊断2型糖尿病；②自然绝经后女性；③男性年龄≥50岁。

1.1.2排除标准：①1型糖尿病、妊娠糖尿病、特殊类型糖尿病或合并糖尿病急性并发症(如高血糖高渗状态、酮症酸中毒)；②合并有恶性肿瘤、甲状腺或甲状旁腺疾病、肠胃营养不良、严重感染等影响骨代谢的其他内分泌疾病或慢性疾病；③合并有过敏性鼻炎、过敏性哮喘、自身免疫性疾病等；④严重的肝肾功能不全；⑤近6个月内有急性心脑血管事件发生者；⑥服用影响骨代谢药物或接受过抗骨质疏松治疗(如双膦酸盐、甲状旁腺素、雌激素、糖皮质激素、免疫抑制剂等)。

1.2 研究方法

1.2.1临床资料的收集：收集两组患者的临床资料，包括性别、年龄、糖尿病病程、身高、体重，并计算BMI。

1.2.2骨密度的测定：采用美国HOLOGIC公司的Discovery A(S/N 87352)骨密度仪双能X线吸收法(DXA)测定腰椎(L1～L4)、全髋及股骨颈骨密度，单位为g/cm2，CV值为1.0%。

1.2.3Sema3A的测定：清晨空腹采集静脉血，分装于离心试管中在室温放置2 h，然后1 000 r/min离心15 min，取上清液将其置于-80 ℃低温冰箱保存待测。采用江莱生物的人Sema3A ELISA试剂盒测定，板内CV值<9%，板间CV值<11%。每例血清样本均设2个测试孔，最终反应板在酶标仪(美国Thermo公司)450 nm处读取吸光度值，并取其2个测试孔吸光度平均值，在Excel工作表中绘制出标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各样本浓度值。

1.2.4骨代谢指标及各生化指标的测定：①血PINP、血OC、血β-CTX均采用电化学法测定；②血BALP、血PTH均采用化学发光法；③血25(OH)D采用双抗夹心酶联免疫法；④血Ca、血Mg、血P采用自动生化分析仪测定；⑤随机UALB/Cr采用透射比浊法；⑥ HbA1c采用高压液相离子交换层析法。

1.3 统计学处理

采用SPSS 22.0统计软件分析处理数据，正态性检验采用单个样本Kolmogorov-Smirnov检验。满足正态分布计量资料用均值±标准差表示，采用t检验；非正态分布计量资料用中位数(四分位数范围)[M(P25～P75)]表示，采用Mann-WhitneyU检验。计数资料用例数表示，采用卡方检验。两个连续性数值变量采用Spearman相关分析。血清Sema3A水平与骨密度及骨代谢指标的相关性采用多元线性回归分析方法。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 2型糖尿病患者的临床资料

2型糖尿病患者骨质疏松组和非骨质疏松组间糖尿病病程、HbA1c、随机UALB/Cr相比差异无统计学意义(均P>0.05)。两组间性别比例、年龄、BMI相比差异有统计学意义(均P<0.01)，其中骨质疏松组年龄高于非骨质疏松组，而BMI水平低于非骨质疏松组。与非骨质疏松组相比，骨质疏松组患者女性占比明显更高。见表1。

表1 2型糖尿病患者的临床资料Table 1 The clinical data of T2DM

2.2 2型糖尿病患者的血清Sema3A、骨密度、骨代谢指标

2型糖尿病患者骨质疏松组腰椎骨密度、全髋骨密度、股骨颈骨密度明显低于非骨质疏松组(均P<0.01)。血清Sema3A水平骨质疏松组显著低于非骨质疏松组(P<0.05)。血清β-CTX在骨质疏松组较非骨质疏松组明显升高(P<0.05)。和非骨质疏松组患者相比，骨质疏松组血PINP、OC、BALP、PTH升高，25(OH)D降低，但差异无统计学意义(均P>0.05)。见表2。

表2 2型糖尿病患者的血清Sema3A、骨密度、骨代谢指标Table 2 Serum Sema3A, BMD, and bone metabolic indicators in T2DM

2.3 2型糖尿病患者血清Sema3A水平与各参数间的相关性

2型糖尿病患者血清Sema3A水平与腰椎骨密度、全髋骨密度、股骨颈骨密度呈正相关，相关系数r分别为0.310、0.239、0.203，P值分别为<0.001、0.006、0.021。血清Sema3A水平与OC呈负相关，相关系数r为-0.177，P值为0.045。Sema3A与PINP、β-CTX、BALP、PTH呈负相关，与25(OH)D呈正相关，但无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 2型糖尿病患者血清Sema3A水平与各参数间的相关性Table 3 The association between serum Sema3A level and other variables

2.4 2型糖尿病患者血清Sema3A与骨密度、骨代谢指标的多元回归分析

多元回归分析结果显示，校正可能的混杂因素年龄、糖尿病病程、BMI、HbA1c后，血清Sema3A与腰椎骨密度、全髋骨密度、股骨颈骨密度均呈正相关(P<0.05)。进一步校正性别后，血清Sema3A水平与腰椎骨密度仍呈正相关(B=0.002，P=0.035)；与全髋骨密度、股骨颈骨密度呈正相关，但无统计学意义(P>0.05)。在校正年龄、糖尿病病程、BMI、HbA1c后Sema3A与PINP呈负相关(B=-0.340，P=0.048)；与OC、β-CTX呈负相关，但无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表4 2型糖尿病患者血清Sema3A与骨密度、骨代谢指标的多元回归分析Table 4 Multiple regression analysis between Sema3A and BMD and bone metabolic indicators in T2DM patients

3 讨论

骨质疏松症多见于绝经后女性及老年男性，我们的研究发现，在2型糖尿病患者中，绝经后女性比男性更容易患骨质疏松，与以往的研究结果一致。这与绝经后女性体内雌激素水平降低后对破骨细胞的抑制作用减弱，导致其骨吸收功能增强有关[7]。在2型糖尿病患者中，骨质疏松组年龄大于非骨质疏松组，表明了骨质疏松症是一种与增龄相关的代谢性疾病[8]。首先，增龄可以导致骨重建失衡，骨吸收与骨形成的比值升高，从而导致进行性的骨量丢失；其次，增龄可以使免疫系统呈低度活化状态，白介素-1(IL-1)、白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)等炎性反应介质可以刺激核因子-κB受体活化因子配体(RANKL)和巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)表达，从而刺激破骨细胞，抑制成骨细胞，造成骨量的减少。有研究[9-10]表明肥胖可能会导致骨密度增加，与骨密度呈正相关，与骨质疏松呈负相关。BMI下降或低BMI是老年女性和男性骨折发生率较高的独立危险因素[11]。本研究也发现骨质疏松组患者BMI更低，这可能与体内较低的17β-雌二醇水平和较低的机械负荷有关。

Sema3A是脊椎动物中发现的第一个信号素。它最初被认为是一种可扩散的轴突导向分子，诱导神经系统的生长和发育。然而，研究发现Sema3A在骨重建中也发挥着重要作用。Sema3A基因敲除小鼠的原代成骨细胞存在分化缺陷，成骨细胞标志物Runx2和Bglap2表达降低[12]，而骨保护素(OPG)缺陷的小鼠颅骨细胞培养液中加入Sema3A能抑制破骨细胞的成熟。在一项基于Sema3A基因治疗的骨靶向给药系统的研究[13]显示，经过Sema3A治疗的小鼠破骨细胞数量明显减少，成骨细胞数量明显增加，骨密度、骨体积/组织体积(BV/TV)、骨小梁数量(Tb.N)和骨小梁厚度(TB.Th)均显著高于对照组。静脉注射Sema3A可加速钻孔损伤所致皮质骨缺损小鼠模型的骨再生，去卵巢(ovariectomized，OVX)诱导的骨质疏松小鼠模型也显示Sema3A可以减少卵巢切除后所致的骨量丢失[12]。在本研究中，我们发现在2型糖尿病患者中，骨质疏松组患者血清Sema3A水平明显低于非骨质疏松组，Sema3A与各部位骨密度呈正相关。其可能的机制有如下几个方面：一方面Sema3A与从状蛋白-A1(plexin-A1)和Nrp1受体复合物结合后影响免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM)信号通路和RhoA激活，从而抑制破骨细胞分化和破骨前体细胞迁移；另一方面Sema3A和Nrp1的结合还可以增加Rac1的表达，促进β-catenin在细胞核内聚集，增加成骨细胞分化、增殖[12]。而高糖可以降低Sema3A及受体Nrp1的表达，显著抑制成骨分化。Ma等[14]研究也表明糖尿病可能通过调节Sema3A/IGF-1/β-catenin信号通路来干扰骨代谢。基于此，调节血清Sema3A水平可能成为骨质疏松治疗的新靶点，特别是为糖尿病合并骨质疏松患者的治疗提供新思路。

既往有研究[15]表明在人体中血清Sema3A水平随年龄的增长或绝经而降低。而本研究显示年龄与Sema3A无明显相关性，分析可能与本研究选取的研究对象年龄较大，不能代表一般人群Sema3A水平有关。OC是一种由成骨细胞分化后期分泌的非胶原性、依赖维生素K的蛋白质，其不仅能够调节成骨细胞及破骨细胞的活性，还是骨矿化速率的调节因子。本研究发现2型糖尿病患者骨质疏松组OC、PINP、β-CTX水平更高，血清Sema3A水平与OC、PINP、β-CTX呈负相关趋势，这可能与骨质疏松患者骨转换增加，成骨细胞、破骨细胞活性增强有关。

本研究也存在一定局限性。首先，因为研究的样本量有限，未能对研究对象进行更详细的分层分析，若后续研究中能够继续扩大样本量，可按照T值进行更详细的分组。其次，由于研究对象为2型糖尿病病人，糖尿病病程相对较长，虽然已调整了一些混杂因素，但可能存在部分混杂因素如血糖等仍未被调整。

本研究发现，2型糖尿病合并骨质疏松患者血清Sema3A水平明显降低，校正骨质疏松的可能影响因素后血清Sema3A水平与腰椎骨密度仍呈正相关，与PINP、OC、β-CTX等骨代谢指标有一定相关性。未来Sema3A可能成为筛选抗骨质疏松药物的新的靶点。