骨康方君臣佐使药治疗骨质疏松药理机制探讨

梁倩欣 董家铭 谢曼琳 邹艳芳 涂兴明,2 赵可伟,2*

1.广州中医药大学，广东 广州 510006

2.广州中医药大学第三附属医院，广东 广州 510378

骨质疏松症(osteoporosis，OP)是一种骨量低下，骨组织微结构损坏，导致骨脆性增加的疾病[1]。随着世界人口的老龄化，OP发病率逐年上升，骨折是其导致的严重后果，给人民的健康带来巨大伤害。目前临床上治疗OP的药物以钙剂和雌激素类药物等为主，具有一定的临床疗效但有副作用不宜长期服用[2]。而中药具有良好的临床诊疗效果，并且其来源广泛、成本低廉和不良反应较小，实验研究也表明中药可提高骨密度，缓解疼痛等症状，在治疗OP方面具有独特的优势。

方剂是由多种中药组成，具有多成分、多靶点的特点，不同中药的配伍有着不同的功效，目前大多数的研究方法仍是选取某个中药或成分进行研究，不能精准解释方剂发挥疗效的物质基础及组方规律等问题[3]，而网络药理学的出现，可作为疾病与中药方剂之间的桥梁，整体、系统地对方剂进行研究。方剂配伍组成的基本原则是君臣佐使，因此君臣佐使各药物的配伍决定方剂治疗及作用的方向。我院经验方骨康方，在临床上可显著缓解OP患者腰腿痛及肾阳虚症状，并且已有研究[4]证明骨康方具有抑制骨吸收和促进骨形成的双重作用。骨康方中君药(补骨脂)、臣药(淫羊藿、肉苁蓉、熟地黄、菟丝子和白芍)、佐药(黄芪、丹参和当归)和使药(大枣)，据文献检索可知已有部分单味药的机制研究，但骨康方药整体的靶点机制异同并未进行系统研究。因此，本研究主要通过网络药理学来探讨骨康方药治疗OP相关靶点及通路的异同，为深入研究骨康方中君臣佐使各药组成的具体意义奠定坚实的基础，同时也可为寻找骨康方的最佳组成提供参考的方向。

1 材料和方法

1.1 药物活性成分及潜在靶点的筛选

通过中药综合数据库(TCMID)获得骨康方君药(补骨脂)的成分，使用中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)筛选其活性成分及其靶点(OB≥30%、DL≥0.18)；在TCMSP以相同条件分别筛选臣药(淫羊藿、肉苁蓉、熟地黄、菟丝子和白芍)、佐药(黄芪、丹参和当归)和使药(大枣)的活性成分及其靶点；同时，通过文献检索补充不在筛选纳入范围内但已有研究表明对OP有明确疗效的活性成分及靶点。通过uniprot (2020年8月3日更新)进行Gene symbol的转化，删除非人类及无数据靶点。使用Cytoscape软件构建活性成分-潜在靶点网络。

1.2 OP靶点的获取

分别在OMIM(2020年9月15日更新)、 TTD (2020年6月1日更新)以及DisGeNET (version:7.0)数据库检索疾病关键词“Osteoporosis”，得到相应的靶点，汇总三个数据库的靶点，去除重复靶点，得到OP靶点数据集。

1.3 中药-疾病交集靶点蛋白相互作用网络(PPI)的构建

通过Venny 2.1将中药靶点和疾病靶点进行比对，分别筛选君药-OP交集靶点、臣药-OP交集靶点、佐药-OP交集靶点和使药-OP交集靶点。利用STRING(version 11.0)分析交集基因间的相互作用，设置置信度>0.9并隐藏游离单结点，分别构建交集靶点之间的PPI。

1.4 中药-疾病关键靶点的KEGG通路富集分析

将PPI导入Cytoscape，分别以degree、closeness和betweenness分析PPI网络，取其大于或等于中位数部分的交集，即为中药-疾病的关键靶点，其中君药的关键靶点不做筛选。使用David(version:6.8)对君臣佐使的关键靶点进行KEGG 通路分析，去除非骨相关的具体疾病名称相关通路，使用Venny 2.1软件对关键靶点的KEGG通路结果进行交集。取P<0.05为显著富集的阈值，在R语言中使用ggplot2软件进行处理。结果按P值大小顺序排列，取前24的结果，气泡大小代表通路的基因数量，P值代表富集的显著程度。

2 结果

2.1 骨康方中药的活性成分及作用靶点

通过数据库和文献检索分别筛选得到君药的活性成分4个，潜在靶点40个；臣药的成分40个，靶点254个；佐药的成分75个，靶点242个；使药的成分19个，靶点202个。见图1。

2.2 骨康方中药-OP的交集靶点

通过数据库对OP进行检索，其中OMIM数据库检索获得42个OP靶点，TTD数据库34个，DisGeNET数据库1 098个，汇总去重后共得到OP靶点1 152个。分别将骨康方中药的潜在靶点与OP靶点进行交集，获得君药-OP的交集靶点12个、臣药87个、佐药86个、使药80个。结果见图2。

2.3 骨康方中药-OP交集靶点的PPI网络

君药-OP交集靶点的PPI网络，具有6节点、8个作用关联；臣药-OP交集靶点的PPI网络，具有78节点、288个作用关联；佐药-OP交集靶点的PPI网络，具有76节点、328个作用关联；使药-OP交集靶点的PPI网络，具有72节点、258个作用关联。见图3。

2.4 骨康方中药-OP关键靶点的KEGG通路富集分析

利用Cytoscape软件获得君药-OP关键靶点有6个、臣药有30个、佐药有31个和使药有30个，结果按degree大小顺序排列，见表1。然后分别对关键靶点进行KEGG通路富集分析，结果见图4。将君臣佐使各药关键靶点的KEGG通路结果进行交集后发现共同通路有9条、君药特有的通路有7条、臣药有2条和使药有1条，而佐药无特有的通路。结果见表2、图5。

表2 KEGG通路交集结果Table 2 Intersection results of KEGG pathway

3 讨论

本研究通过网络药理学对骨康方中君臣佐使各药的具体靶点及通路进行探讨，以对比君臣佐使各药对OP具体作用的异同，试图通过中药分子作用机制解释君臣佐使组成及配伍的具体意义。通过构建不同交集靶点的PPI网络后分别筛选出关键靶点，发现君药的部分关键靶点在臣佐使药中也分别存在，说明臣佐使药可能通过这些共同的关键靶点辅佐君药发挥其主要的作用治疗OP，同时我们对关键靶点进行degree排序后发现君臣佐使的共同关键靶点排序有所不同，那么君臣佐使各药可能治疗OP的侧重点有所不同，符合君臣佐使在方剂中负责的部分不同。

本研究通过对骨康方中君臣佐使各药关键靶点的KEGG通路结果进行交集，发现一共有9条通路为君臣佐使各药的共同通路，其中雌激素信号通路与OP过程密切相关，有研究表明部分中药具有类雌激素作用，可通过雌激素受体作用于相关的骨代谢过程进而影响OP的进程[5]；其他的共同通路虽与OP没有直接的关系，但通过KEGG官网对共同通路进行搜索发现，它们大多参与细胞生长、死亡及环境[6-7]、调控激素影响内分泌系统及生长发育[8]以及调节钙离子[9]等，特别值得注意的是这些通路与MAPK通路有联系，而文献检索显示MAPK通路可调控成骨细胞的增殖分化[10]，雌激素受体信号通路在MAPK信号通路的上游[11]，所以推测骨康方的君臣佐使各药可能通过MAPK通路对OP进行调控。同时交集结果显示君药有7条独特的通路、臣药有2条、使药有2条，而佐药无自己独特的通路。其中君药的7条通路与Ca离子信号通路有关[12-13]，钙是构成骨骼的重要物质[14]，对钙离子通路的调控可影响骨代谢过程，有研究表明左归丸可通过上调肾钙和骨钙转运通路中相关蛋白的表达来发挥抗OP的作用[15]，那么君药可能通过调节钙离子通路促进骨形成从而影响OP的进展。臣药的2条独特通路主要与免疫调节的相关通路有关[16]，淋巴细胞的部分增殖分化过程在骨髓内进行，与骨髓造血共享同一个微环境，可共享微环境中的各种物质，所以免疫因子、通路的变化可影响共享的微环境，从而影响骨细胞的相关过程[17]。使药的1条独特通路与细胞间粘附连接过程有关，这过程对维持组织结构和细胞极性非常重要，并且可以限制细胞的移动和增殖[18]。综上，君臣佐使各药具有独特的通路，并且它们影响的细胞过程也不同。君药主要集中于钙离子通路，可能通过钙离子通路促进骨形成，从而缓解OP的主要症状——疼痛；臣药主要与免疫微环境相关，可能通过调节免疫微环境间接影响骨代谢过程，从而辅助君药缓解疼痛的症状；而使药则是对基础的细胞过程起作用，起到调和诸药的作用，符合君臣佐使的相关理论。

综上所述，骨康方的君臣佐使各药有共同的作用靶点及相关的通路，证明了它们作用时密切相关、相互辅佐，可能通过MAPK通路共同完成对OP的治疗作用，与此同时，它们又各自具有一定治疗特点的靶点及通路，发挥自己独特的作用。