银杏素促进成纤维样滑膜细胞中TRAF3蛋白的表达缓解类风湿关节炎

吕昌伟 张静涛 郗海涛 强毅 张乾

西北大学附属医院/西安市第三医院骨科，陕西 西安 710018

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种以滑膜组织炎症、滑膜增生、关节软骨破坏和关节畸形为特征的慢性自身免疫性疾病[1]。成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes，FLS)是构成滑膜结构的主要细胞[2]，大量证据[3]表明FLS的异常激活是RA的发生与发展的重要因素，活化的RA-FLS表现出过度增殖和细胞凋亡不足等特征，同时能够分泌大量炎症因子如白细胞介素(interleukin，IL)-1β和IL-6介导炎症反应。因此，抑制FLS的异常激活被认为是预防RA进展的有效策略。

有研究[4]报道了中草药银杏可作为免疫调节剂，是治疗类风湿关节炎等自身免疫性疾病的潜在药物。银杏素(ginkgetin)是从银杏叶中提取的一种天然双黄酮类化合物，已被证明具有抗炎、抗真菌、抗癌、增强免疫调节和神经保护活性等作用，在多种疾病治疗中具有广泛的应用前景[5]。目前银杏素对类风湿关节炎的治疗作用尚不明确。本研究拟从体内和体外探讨银杏素在TNF-α诱导的FLS炎症模型和胶原诱导的关节炎(collagen-induced arthritis，CIA)大鼠模型中的作用和机制，以期为RA的治疗提供新的策略。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1实验动物：选取SPF级健康雄性Sprague Dawley大鼠，体质量(200±20)g，由西北大学附属医院/西安市第三医院动物实验中心提供。所有大鼠均饲养在标准环境中：12 h明暗循环，室温(22±2)℃，可自由进食和饮水。本研究所有实验经西北大学附属医院/西安市第三医院动物伦理委员会审核批准。

1.1.2试剂与仪器：试剂：银杏素(美国Sigma-Aldrich)；茴香霉素(美国Sigma-Aldrich)；MH7A细胞(中国广州Jennio Biotech)；si-TRAF3和其阴性对照(中国上海GenePharma)；胎牛血清和DMEM(美国Gibco)；LipofectamineTM3000转染试剂(美国Invitrogen)；CCK-8试剂盒(日本Dojindo)；Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒(美国BD Biosciences)；ELISA试剂盒(美国R&D Systems)；蛋白抗体(美国Abcam)；裂解缓冲液及BCA蛋白浓度测定试剂盒(中国上海Beyotime)。仪器：流式细胞仪(美国BD Biosciences)。

1.2 方法

1.2.1银杏素溶液的制备：用二甲基亚砜(DMSO)溶解银杏素以制备50 mmol/L储备溶液，再用无血清DMEM培养基溶解至实验浓度，DMSO的终浓度小于0.1 %。银杏素溶液通过0.22 μm过滤器除菌并储存在- 4 ℃。

1.2.2细胞培养、处理和转染:成纤维样滑膜细胞MH7A孵育在含有10 %胎牛血清和抗生素(100 U/mL青霉素和0.1 mg/mL链霉素)的DEME培养基中，置于含有5 % CO2的37 ℃恒温培养箱中培养。此外，用10 ng/mL的TNF-α刺激MH7A细胞来模拟RA的局部炎症。利用Lipofectamine 3000转染试剂并根据说明将si-TRAF3及其阴性对照scramble转染到MH7A细胞中。转染48 h后收集细胞用于后续实验。

1.2.3CCK-8检测细胞活力与增殖：将2×104个细胞接种于96孔板，于培养第24、48和 72 h向每个孔中加入10 μL CCK-8试剂，在含有5 % CO2的37 ℃恒温培养箱中培养2 h，通过酶标仪检测450 nm处的吸光度值。

1.2.4流式细胞术检测细胞凋亡：收集处理后的MH7A细胞，PBS洗涤两次，以2×105个细胞/mL的浓度将细胞重悬于100 μL结合缓冲液中，加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，于4 ℃避光孵育15 min，使用流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.2.5CIA大鼠模型构建及药物处理：在30只SD大鼠中随机选取8只为对照(Control)组，剩余22只用于建立CIA大鼠模型。CIA大鼠模型构建：参照先前文献报道的方法[6]，将牛II型胶原溶解在0.05 mol/L乙酸溶液中至终浓度为2 mg/mL，4 ℃下过夜充分溶解，再与等体积的弗氏不完佐剂于冰浴中混合，得到终浓度为1 mg/mL的胶原乳剂，首次于大鼠尾根部皮下注射200 μL胶原乳剂，第8天再次注射200 μL加强免疫。Control组用等量的生理盐水处理。该模型在18只大鼠中成功建立，关节炎指数评分>6分。然后，随机选择16只造模成功的SD大鼠，分为CIA组(n=8)和CIA+银杏素组(n=8)。于造模第22天开始，CIA+银杏素组大鼠每天口服给药银杏素100 mg/kg，连续21 d。同时，Control组和CIA组大鼠每天口服等量的生理盐水。造模第42天，三组大鼠全部存活，将大鼠安乐死，收集大鼠关节组织用于后续实验。

1.2.6关节炎指数评分:造模后每隔7天对大鼠关节炎病变的发生及严重程度进行评分，采用关节炎指数(arthritis index，AI)评分方法(0～4分)：0分：无红肿；1分：小趾关节轻度发红或肿胀；2分：小趾和足趾关节肿胀，发红；3分：踝关节以下的整个足爪全部肿胀和发红；4分：包括踝关节在内整个足部严重肿胀和发红，丧失活动能力。每只大鼠四肢评分相加计算AI值，超过6分可判断为模型成功诱导。

1.2.7关节肿胀度测定:采用水容积法测量大鼠关节肿胀度，从造模开始每7天测量一次大鼠后足容积，记录容积值，直至实验结束。计算其关节肿胀度。关节肿胀度表示为当前容积与造模前容积的差值。

1.2.8病理学观察:造模第42天，处死所有大鼠，将踝关节组织在10 %甲醛溶液中固定24 h，EDTA脱钙，石蜡包埋，制备组织切片，HE(hematoxylin and eosin)染色，显微镜下观察病理形态。

1.2.9酶联免疫吸附(ELISA)检测IL-6和IL-1β含量：收集处理后的MH7A细胞和关节组织样品上清液，根据使用说明，用酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒检测TNF-α、IL-6和IL-1β的水平。

1.2.10Western blotting检测蛋白表达：使用RIPA裂解缓冲液裂解MH7A细胞以及大鼠滑膜组织并提取总蛋白。总蛋白质浓度通过BCA蛋白质分析试剂盒进行定量。将等量的蛋白质在SDS-PAGE上分离并转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，在37 ℃下，用5 %脱脂奶室温封闭2 h。然后将膜与以下抗体在4 ℃孵育过夜：anti-TRAF3(1∶1 000, Abcam，ab239357)，anti-p38(1∶1 000，Abcam，ab170099)，anti-p-p38(1∶1 000，Abcam，ab178867)和anti-GAPDH(1∶2 500，Abcam，ab9485)。用TBST缓冲液洗涤后，与辣根过氧化物酶(HRP)偶联的二级抗体(1∶2 000，Abcam，ab6721)在37 ℃下孵育1 h。用TBST洗涤后，用ECL检测试剂将蛋白条带可视化，使用Image LabTM软件定量分析蛋白条带的强度，计算目标蛋白的相对表达。

1.3 统计学分析

采用SPSS 22.0软件进行统计学分析，实验结果用平均值±平均值的标准误差(SEM)表示，组间数据差异用t检验(两组间比较)和单因素方差分析(多组间比较)。P<0.05被认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 银杏素降低TNF-α刺激的MH7A细胞活力

图1A为银杏素的分子结构。用TNF-α刺激MH7A细胞建立炎症模型，用不同浓度的银杏素处理48 h后检测细胞活力。如图1B所示，TNF-α刺激增强MH7A细胞活力，而银杏素以剂量依赖性的方式降低TNF-α刺激的MH7A细胞活力，其浓度为40 μmol/L时对细胞增殖的抑制作用最为明显。

图1 银杏素降低TNF-α刺激的MH7A细胞活力Fig.1 Ginkgetin reduces TNF -α-stimulated MH7A cell viability注：A：银杏素的分子结构；B：不同浓度银杏素对降低TNF-α刺激的MH7A细胞活力影响。与未受任何处理的MH7A细胞活力比较，*P<0.05；与TNF-α刺激的MH7A细胞活力比较，#P<0.05，##P<0.01。

2.2 银杏素抑制TNF-α刺激的MH7A细胞增殖和炎症因子分泌，促进细胞凋亡

与对照组相比，TNF-α刺激导致MH7A细胞增殖增强(图2A)，凋亡减少(图2B)，炎症因子IL-6和IL-1β分泌增加(图2C、图2 D)。而40 μmol/L银杏素处理能够显著抑制TNF-α刺激的MH7A细胞增殖和炎症因子分泌，促进细胞凋亡。

2.3 银杏素通过上调TRAF3抑制TNF-α刺激的MH7A细胞增殖和炎症因子分泌，促进细胞凋亡

用银杏素单独或与si-TRAF3共同处理TNF-α刺激的MH7A细胞。Western blotting结果表明，TNF-α刺激降低了TRAF3表达，而银杏素处理上调TRAF3表达，转染si-TRAF3则逆转银杏素对TRAF3表达的促进作用(图3A)。此外，银杏素抑制了TNF-α刺激的MH7A细胞增殖(图3B)，促进细胞凋亡(图3C)，抑制了炎症因子IL-6和IL-1β分泌(图3D、图3E)。而转染si-TRAF3显著逆转了银杏素对MH7A细胞增殖、凋亡和炎症因子分泌的调节作用。结果表明银杏素能够通过上调TRAF3抑制TNF-α刺激的MH7A细胞增殖和炎症因子分泌，促进凋亡。

图2 银杏素调节TNF-α刺激的MH7A细胞增殖、凋亡和炎症反应Fig.2 Ginkgetin modulates TNF -α-stimulated MH7A cell proliferation, apoptosis, and inflammatory response注：A：CCK-8法检测MH7A细胞增殖；B：流式细胞仪检测MH7A细胞凋亡；C：ELISA 检测MH7A细胞培养上清液IL-6含量；D：ELISA 检测MH7A细胞培养上清液IL-1β含量。*P<0.05，**P<0.01。

图3 银杏素通过上调TRAF3调节TNF-α刺激的MH7A细胞增殖、凋亡和炎症反应Fig.3 Ginkgetin modulates TNF-α-stimulated MH7A cell proliferation, apoptosis, and inflammatory response by upregulating TRAF3 expression注：A：Western blotting 检测TRAF3蛋白表达；B：CCK-8法检测MH7A细胞增殖；C：流式细胞仪检测MH7A细胞凋亡；D：ELISA 检测MH7A细胞培养上清液IL-6含量；E：ELISA 检测MH7A细胞培养上清液IL-1β含量。*P<0.05，**P<0.01。

2.4 银杏素通过阻断p38 MAPK通路抑制TNF-α刺激的MH7A细胞增殖和炎症因子分泌，促进凋亡

图4 银杏素通过阻断p38 MAPK通路调节TNF-α刺激的MH7A细胞增殖、凋亡和炎症反应Fig.4 Ginkgetin modulates TNF-α-stimulated MH7A cell proliferation, apoptosis, and inflammatory response by blocking the p38 MAPK pathway注：A：Western blotting 检测p-p38/p38蛋白表达；B：CCK-8法检测MH7A细胞增殖；C：流式细胞仪检测MH7A细胞凋亡；D：ELISA 检测MH7A细胞培养上清液IL-6含量；E：ELISA 检测MH7A细胞培养上清液IL-1β含量；F：Western blotting 检测p-p38/p38、p-p65/p65和p-JNK/JNK蛋白表达。*P<0.05，**P<0.01。

为了探究银杏素对p38 MAPK信号通路的影响，用银杏素单独或与p38激动剂茴香霉素共同处理TNF-α刺激的MH7A细胞。Western blotting结果表明，TNF-α刺激增强了p-p38蛋白表达，p38 MAPK信号通路被激活。而银杏素处理抑制了p-p38蛋白表达，阻断p38 MAPK信号通路。用茴香霉素处理则逆转银杏素对p-p38蛋白表达和p38 MAPK信号通路的抑制作用(图4A)。此外，茴香霉素处理显著逆转了银杏素处理导致的MH7A细胞增殖降低(图4B)，使凋亡(图4C)、炎症因子IL-6和IL-1β分泌增加(图4 D、图4E)。同时，笔者发现转染si-TRAF3显著减弱了银杏素对p38 MAPK信号通路的抑制作用(图4F)。此外，本研究还检测了银杏素通过上调TRAF3对NF-κB和JNK信号通路的影响，如图4F所示，TNF-α刺激增加了p-p65和p-JNK蛋白表达，NF-κB和JNK信号通路被激活。而银杏素处理对p-p65和p-JNK蛋白表达没有明显的抑制作用，且转染si-TRAF3对p-p65和p-JNK蛋白表达没有明显的促进作用。这些结果表明银杏素能够通过阻断p38 MAPK通路抑制TNF-α刺激的MH7A细胞增殖和炎症因子分泌，促进凋亡。

2.5 银杏素通过上调TRAF3缓解CIA大鼠的关节症状

用胶原诱导建立CIA大鼠模型，探究银杏素对RA的作用及机制。与对照组相比，大鼠造模后关节炎指数评分和足爪肿胀度不断升高，于造模后第21天达到最高值，大鼠的双侧足爪关节出现明显发红和肿胀。造模第22天开始每天灌胃银杏素[50 mg/(kg·d)]治疗21 d，与CIA组相比，银杏素治疗的大鼠关节炎评分和足爪肿胀度均显著降低(图5A、图5B)。滑膜组织病理学评估显示，对照组呈现清晰光滑的组织，无炎性细胞浸润和滑膜增生，CIA组表现出明显的炎性细胞浸润、滑膜增生和血管翳形成，而银杏素治疗有效地减轻了CIA大鼠的滑膜炎性细胞浸润以及滑膜增生。此外，Western blotting结果表明造模42 d后，CIA大鼠关节滑膜组织中TRAF3蛋白表达降低，银杏素处理上调TRAF3蛋白表达(图5C)。ELISA结果表明CIA大鼠关节组织炎症因子TNF-α, IL-6和IL-1β含量明显升高，而银杏素处理显著降低CIA大鼠关节组织炎症因子的含量(图5D～图5F)。上述结果表明银杏素能够通过上调TRAF3缓解CIA大鼠的关节炎。

图5 银杏素通过上调TRAF3缓解CIA大鼠的关节炎Fig.5 Ginkgolin alleviates arthritis in CIA rats by upregulating TRAF3 expression注：A：CIA大鼠关节炎指数评分；B：CIA大鼠足爪肿胀度；C：Western blotting检测CIA大鼠滑膜组织TRAF3蛋白表达；D：ELISA检测CIA大鼠滑膜组织TNF-α含量；E：ELISA检测CIA大鼠滑膜组织IL-6含量；F：ELISA检测CIA大鼠滑膜组织IL-1β含量。CIA组相比于Control组，*P<0.05，**P<0.01；CIA+银杏素组相比于CIA组，#P<0.05，##P<0.01。

3 讨论

RA是一种慢性自身免疫性疾病，其特征在于滑膜组织炎症、滑膜增生以及关节软骨破坏。目前RA的治疗药物有许多，包括传统的改善疾病的抗风湿药物和逐渐受到重视的生物制剂，但这些药物的治疗效果仍不是很理想[7]。因此，开发治疗类风湿关节炎的新药一直受到重视。银杏素是银杏叶中的一种天然双黄酮类化合物，对许多疾病具有药理活性，包括癌症[8]、动脉粥样硬化[9]、阿尔茨海默症[10]以及炎性疾病[11]。此外，银杏素曾被报道[12]在大鼠佐剂性关节炎中表现出较强的抗关节炎活性和镇痛活性，可能是潜在的抗关节炎药。鉴于其抗炎和免疫调节作用，本研究探讨了银杏素在TNF-α诱导的FLS炎症模型和CIA大鼠模型中的作用及机制，结果表明银杏素抑制了FLS的细胞增殖并诱导细胞凋亡，同时能够抑制炎症因子IL-6和IL-1β分泌。进一步的体内研究证明，银杏素能够有效缓解CIA大鼠的关节炎。

TNF受体相关因子3属于TNF受体相关因子蛋白家族，是多种炎症反应的负调节因子[13]。先前研究[14]发现TRAF3能够显著抑制IL-17诱导的NF-κB和MAPKs活化，在TRAF3转基因小鼠中，消除IL-17对软骨的破坏作用，提示TRAF3是软骨退化和骨关节炎的潜在新治疗靶标。此外，有研究[15]报道了CIA大鼠滑膜免疫炎性损伤与TRAF3低表达相关，中药处方藤莓汤可能通过上调TRAF3表达抑制NF-κB信号通路激活，进而抑制炎症反应，改善CIA模型大鼠滑膜免疫炎性损伤。值得注意的是，有研究[16]发现一种天然黄酮类化合物槲皮素，能够通过上调TRAF3表达抑制NF-κB信号转导，对咪喹莫特诱导的小鼠有明显的抗银屑病作用。银杏素也属于黄酮类化合物，因此笔者推测银杏素缓解CIA大鼠关节炎的作用机制可能与调节TRAF3表达相关。本研究结果表明在TNF-α诱导的FLS炎症细胞模型和CIA大鼠模型中，银杏素上调了TRAF3表达，进而调节FLS增殖、凋亡和炎症因子分泌，减轻CIA大鼠的关节炎。

丝裂原活化蛋白激酶MAPK通路的激活与炎症反应有关。越来越多的研究[17-18]报道了p38 MAPK信号通路是RA中介导关节炎症和软骨损伤的关键信号传导途径，它参与持续炎症、滑膜增殖、血管翳形成和关节破坏，是促进RA发生和发展的重要因素。研究报道在CIA大鼠中，LXA4能够抑制p-p38表达并阻断p38 MAPK信号通路。LXA4和SB203580(p38抑制剂)均降低了CIA大鼠的关节炎指数评分以及炎症因子分泌，而茴香霉素(p38激动剂)可以逆转LXA4对CIA大鼠关节炎症的保护作用。因此，p38 MAPK通路是RA治疗的潜在有效靶标[19]。值得注意的是，之前的研究[20]证明了TRAF3是MAPK信号传导的负调节因子。本研究表明TRAF3表达下调与RA相关，银杏素通过上调TRAF3表达，抑制p-p38蛋白表达，阻断p38 MAPK信号通路，抑制FLS增殖并诱导凋亡，同时抑制炎症因子IL-6和IL-1β分泌，进而减轻CIA大鼠的关节炎。

综上所述，本研究发现在TNF-α诱导的FLS炎症细胞模型和CIA大鼠模型中，TRAF3表达下调，而银杏素通过上调TRAF3表达，抑制了FLS增殖并诱导凋亡，同时抑制炎症因子IL-6和IL-1β分泌，减轻CIA大鼠的关节症状，其机制与TRAF3介导的p38 MAPK通路失活有关。