咬合支持改变对幼年大鼠骨代谢及骨微结构的影响

刘艳飞 李伯琦 陈朝旭 刘奕杉*

1.新疆医科大学第一附属医院(附属口腔医院)儿童口腔科-口腔预防科，新疆 乌鲁木齐 830054 2.新疆维吾尔自治区口腔医学研究所，新疆 乌鲁木齐 830054

近年来，人们越来越关注口腔疾病对全身健康的影响。牙齿脱落，冠、桥或假牙的垂直尺寸不足引起的咀嚼功能障碍会对身体、心理、生活质量产生影响。大量研究表明[1-2]，咀嚼功能障碍作为慢性应激源会激活下丘脑-垂体-肾上腺(hypothalamus-pituitary- adrenal，HPA)轴，导致循环糖皮质激素(glucocorticoid，GC)水平升高并引发各种疾病，如海马依赖性认知缺陷。由于GC被认为是“应激”的标志，因此咬合不协调会导致机体产生一定的压力。众所周知，过量接触GC会导致骨质减少。例如儿童使用类固醇药物治疗相关疾病，如哮喘和皮肤过敏，通常对骨骼有不良反应，包括骨折和骨骼生长减慢[3]。鉴于应激诱导的激素对骨代谢的显著影响，有必要评估咬合支持改变引起的应力对骨组织的影响。

1 资料与方法

1.1 实验动物及分组

由新疆医科大学动物实验中心提供的SPF级健康4～5周龄SD大鼠18只(雄性)，体重50～60 g，动物伦理审查批号(2016D01C316)，适应性饲养一周，自由进食水，随机分为3组。

1.2 主要试剂和仪器

注射水合氯醛、PBS盐酸缓冲液(上海中杉金桥)，4%多聚甲醛缓冲液，CRH、ACTH、CORT、BGP、TRACP-5试剂盒(上海江莱)、5%EDTA脱钙液、HE染色剂、移液器、小号止血钳、光学显微镜(德国莱卡)、蜡切片机、显微采片石、生物组织自动包埋机(德国莱卡)。

1.3 模型建立

所用实验组动物均用水合氯醛(35 mg/100 g)腹腔注射麻醉，A组不拔牙，B组拔除单侧磨牙，C组同时拔除双侧磨牙，实验组用小号止血钳拔除磨牙，术中动作轻柔，尽量拔除完整牙齿，若牙冠折断、去除可见牙体组织，消除后牙咬合，压迫止血后，常规颗粒饲料喂养，观察大鼠一般情况及体重情况。

1.4 标本制备

造模后4周尾巴采血及8周后麻醉状态下腹主动脉(采血时间20：00)，4 ℃静置2 h、3 000 r/min离心 15 min，分离血浆，分装于EP 管，-80 ℃冷冻保存备用；采血致死后迅速剥离股骨并用生理盐水冲洗置于4%多聚甲醛磷酸缓冲液(0.1 mol、pH=7.4)中固定48 h，左侧股骨EDTA脱钙后常规石蜡包埋，切4 μm厚骨组织切片标本，每只取5张连续切片置于载玻片进行HE染色；右侧股骨置入PBS缓冲液中行Micro-CT扫描。

1.5 指标检测和方法

按试剂盒说明，采用ELISA法检测血浆CRH、ACTH、CORT、BGP和TRACP-5b的表达。通过HE染色，光学显微镜下观测大鼠股骨组织病理学改变。影像学检测，以17.96 μm分辨率扫描大鼠右侧远端股骨，管电流为280 μA，管电压为80 kV，曝光时间为280 ms，旋转角度0.5 deg，扫描完成后，将Micro-CT数据传到工作站，感兴趣区域是距离股骨远端的生长板0.5～2 mm处100片切片进行三维重建以及对骨小梁三维微结构参数进行测量。测量参数包括骨体积分数(BV/TV)、骨小梁数量(TB.N)、骨小梁分离度(Tb.Sp)、骨小梁厚度(Tb.Th)。

1.6 统计学处理

应用 SPSS 22.0统计软件进行统计分析，实验结果以均数±标准差做统计描述。多组间比较应用单因素方差分析，多组间两两比较采用 LSD 检验(方差齐性)和 Tamhane’s T2 检验(方差不齐)，P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠体重情况

术后1 d大鼠正常颗粒饮食，毛发正常，拔牙前、术后4周和8周的大鼠各组间体重差异无统计学意义(P<0.05)，进一步两两比较任意两组间差异无统计学意义(P>0.05)，详见表1。

表1 三组大鼠不同时间体重比较

2.2 ELISA检测HPA轴相关激素水平

随着咬合支持改变加重，大鼠血浆中CRH、ACTH、CORT表达呈上升趋势，三组大鼠表达差异有统计学意义(P<0.001)，进一步两两比较大鼠血浆中CRH、ACTH、CORT的表达，任意两组间差异均有统计学意义(P<0.001)，详见表2。

2.3 ELISA检测骨代谢相关激素水平

随着咬合支持改变加重，大鼠血浆BGP呈显著下降趋势，TRACP-5b的表达呈下降趋势；三组大鼠血浆中BGP的表达差异有统计学意义(P<0.05)，TRACP-5b的表达差异无统计学意义(P>0.05)；进一步两两比较，BGP任意两组间差异均有统计学意义(P<0.05)；TRACP-5b任意两组间差异无统计学意义(P>0.05)，详见表3。

表2 三组大鼠血浆CRH、ACTH、CORT水平比较Table 2 Serum CRH, ACTH, CORT levels in three groups (ng/mL,

表3 三组大鼠血浆BGP、TRACP-5b水平

2.4 HE染色结果显示

随着咬合支持改变加重，大鼠股骨呈现不同的组织学改变，A组股骨骨小梁组织形态结构正常，无明显病理性改变；B、C两组大鼠骨小梁变细、数量明显减少，排列疏松；C组甚至断裂，骨小梁结构出现较多大的空白区域，详见图1。

图1 三组大鼠股骨骨组织变化(HE 染色×100)Fig.1 Changes of the femoral bone tissue in rats (HE staining, ×100)

2.5 Micro-CT检测大鼠股骨结果

随着咬合支持改变加重，大鼠股骨骨小梁体积分数(BV/TV)、小梁数(Tb.N)和小梁厚度(Tb.Th)呈降低趋势，骨小梁分离度(Tb.Sp)呈升高趋势；三组差异有统计学意义(P<0.01)。进一步两两比较，任意两组间差异均有统计学意义(P<0.05)，详见图2、3。

图2 大鼠各组股骨骨组织微结构变化(Micro-CT)Fig.2 Microstructural changes of the femoral bone in each rat group (micro-CT)

图3 三组大鼠股骨骨小梁BV/TV、Tb.N、Tb.Th、Tb.Sp的比较Fig.3 Comparison of trabecular BV/TV, Tb.N, Tb.Th, and Tb.Sp of the femur among the three groups注：*P<0.05。

3 讨论

HPA轴是一条直接作用与反馈互动的复杂集合的神经内分泌轴，参与控制应激反应，以维持人体内环境稳定[4]。HPA轴保持稳态的机制广泛依赖于几个关键调节分子的释放和摄取，应激信号沿神经中枢传入下丘脑室旁核，会引起促肾上腺皮质激素释放激素(corticotropin releasing hormone，CRH)的释放，CRH通过垂体门静脉系统促进垂体前叶合成、分泌促肾上腺皮质激素(adrenocoticotropic hormone，ACTH)，后者可诱导肾上腺皮质束状带-网状带合成和释放GC使机体发生防御反应，GC人体中主要为皮质醇(cortisol，COR)，啮齿动物主要为皮质酮(corticosterone，CORT)，这些循环皮质类固醇调节大量生理过程，并且还负责激活脑内的糖皮质激素受体(glucocorticoid recepor，GR)来启动HPA轴上的负反馈环路，抑制皮质类固醇的过度产生。然而，重复或延长的HPA轴活动会持续增加循环GC水平循环，过多的GC会破坏HPA轴的负反馈系统，进一步增强了GC的分泌[5]。造模后实验组大鼠血浆CRH、ACTH、CORT水平显著增加，这与暴露于各种慢性压力如束缚、强迫游泳、噪声、拥挤、社会环境等导致啮齿类动物中的应激激素皮质酮水平持续升高[6-7]相一致，因此大鼠长期咬合不调可作为慢性压力使机体产生应激反应，与此同时，本研究发现咬合支持完全丧失对大鼠HPA轴活动影响最大。

骨骼是GC的受体之一，在生理剂量下通过未成熟和成熟成骨细胞在早期骨骼中起作用；而超生理剂量的糖皮质激素则会影响成骨细胞、骨细胞和破骨细胞，从而影响骨骼的发育[8]。目前认为BGP是反映机体的骨组织形成重要指标、TRACP-5b是骨吸收和破骨细胞活性的重要标志物[9-11]。SD大鼠在3～4月龄时骨形成和骨吸收活跃程度最高，骨量达到峰值[12]。与对照组相比，随着咬合不调程度的加重，大鼠股骨血浆中BGP随之降低，TRACP-5b随之轻微升高，这说明大鼠咬合不调影响了骨代谢，循环中升高的CORT抑制了成骨细胞功能，而TRACP-5b轻微的增加可能与成骨细胞和骨细胞对破骨细胞募集和活化有关[13]。HE结果显示实验组骨小梁数量减少、变细，而双侧磨牙缺失(C)组病理学改变较严重出现了较多空白区域，Micro-CT结果显示与对照组(A)相比，B和C组BV/TV分别降低了13.4%和23.8%，Tb.N分别降低了28.2%和58.9%，Tb.Th分别降低了9.9%和20.2%，Tb.Sp分别升高了12.4%和26.4%，这可能是由于循环中CORT的升高抑制成骨细胞的骨形成进而使骨转换降低影响骨稳态导致骨量减少、骨形态改变。

大鼠一般情况正常，三组大鼠在每日食物摄入量和总体营养状况方面无任何显著差异。与对照组相比实验组体重稍降低，但差异无统计学意义，这与其他研究结果[2]一致。据报道，体重增加或减少10%以内对骨量几乎没有影响[14]。因此，体重不是其主要影响因素。

综上所述，幼年大鼠长期咬合不调作为慢性应激源异常活化HPA轴，持续增加循环CORT水平。升高的CORT对成骨细胞的代谢及分子信号通路有负面影响，破坏成骨细胞和破骨细胞的动态稳定，体现在骨小梁形态学改变及骨质丢失。此外，通过对咬合支持改变对幼年大鼠股骨骨小梁的影响研究的结果发现咬合完全丧失对骨小梁影响更严重。临床中加强对缺失牙的修复及咬合调整是否会缓解对骨质的影响尚可未知，有待进一步研究。