牛膝杯苋甾酮激发大鼠骨髓间充质干细胞体外迁移及CXCR4表达的研究

陈鸿泰 罗毅文 陈东风 徐亮亮,3 刘亚梅* 王斌* 谢平金

1.广州中医药大学，广东 广州 510405 2.广州中医药大学第三附属医院，广东 广州 510240 3.广州中医药大学第一附属医院，广东 广州 510405 4.上海中医药大学深圳医院/深圳市罗湖区中医院，广东 深圳 518000

骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)作为一种多能干细胞，在通过一定条件下诱导向成骨、软骨和脂肪等分化来修复受损的组织器官[1]。已有研究表明，骨折时BMSCs被周围组织或循环中诱导并募集至骨折端对骨修复，BMSCs浓度总量增加可促进骨折愈合[2-4]。骨折早期，部分BMSCs通过血液循环到达骨折部位，并快速地增殖并向骨/软骨细胞分化[5]。然而，通过循环系统注射的BMSCs只有少部分到达受损部位[6]。高效促进BMSCs向骨折部位定向归巢，BMSCs趋化性研究是目前的热点。本课题组前期研究发现补肾活血法方药可促进BMSCs的体外迁移，加快骨折修复过程。其中补肾组乙酸乙酯部位能有效促进BMSCs增殖，而促进BMSCs迁移的有效部位在活血组[7]。通过对活血组中药即当归、红花、没药、川牛膝的挥发油和乙醇回流提取物(简称醇提物)进行深入研究，结果表明，红花挥发油、川牛膝醇提物不仅促进SD大鼠BMSCs增殖、迁移，还可动员干细胞巢内的BMSCs进入外周血。RNA测序结果表明，杯苋甾酮作为川牛膝醇提物的有效成分之一，可以促进BMSCs的C-X-C型趋化因子受样4(C-X-C chemokine receptor type4, CXCR4)-表达。本研究拟通过杯苋甾酮对大鼠BMSCs体外迁移能力及CXCR4表达的影响，揭示中医活血法促进BMSCs迁移、加快骨折修复的内在分子机制。

1 材料和方法

1.1 动物 SPF 级

SD大鼠，雄性，4 周龄，体重80～90 g，共2只[广州中医药大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(粤)：2013-0034]。

1.2 主要试剂及仪器

胎牛血清(FBS)(美国 Hyclone 公司)，磷酸盐缓冲液(PBS)(美国 Hyclone 公司)，DMEM 低糖培养基(美国 Gibco 公司)，0.25 %胰蛋白酶(美国 Gibco 公司)，CXCR4抗体(Abcam公司)，山羊抗兔二抗(北京博奥森公司)，FITC荧光试剂盒(北京博奥森公司)，吉姆萨染液(广州瑞舒公司)，二甲基亚砜(DMSO)(美国 Sigma 公司)，CXCR4沉默质粒(吉玛公司)，SCW-HS-840型超净工作台(苏州市长春电子仪器厂)，CKX31型倒置显微镜(日本OlymPus 公司)，B16UUCO2培养箱(德国 Heraues 公司)，25 cm2培养瓶(美国 Corning公司)，Transwell板(24孔、6 孔,聚酯透明膜,3.0 μm)(美国 Corning公司)。

1.3 BMSCs 的分离及培养[8]

颈椎脱臼处死大鼠，在超净台无菌下分离出股骨与胫骨，剪断干骺端，置于双抗DMEM培养基，用无血清DMEM培养基对骨髓腔进行冲洗并收集冲洗液，离心8 min(1 000 r/min)后弃上清液；于4 mL完全培养基(含10 %FBS)混匀沉淀，接种于25 cm2培养瓶中(37 ℃)、5% CO2培养箱中培养。24 h培养后，换液。以后每2 d换液一次，至细胞融合度为80%～90%，消化细胞传代并标记为P1，传代的细胞每3～4 d换液一次，传代至P3。

1.4 MTT细胞增殖实验

取P3 BMSCs制备单细胞悬液，调整细胞浓度(5×104个/mL)，接种于96孔板，5×103/孔，细胞贴壁后，培养基培养24 h，分别加入牛膝杯苋甾酮按照5、10、20 μg/mL浓度梯度培养48 h，加入MTT 20 μL(5 mg/mL)，继续在37 ℃培养箱中培养4 h，吸取上清液，每孔加入二甲基亚砜(DMSO)，150 μL振摇10 min，用酶标仪测吸光度值(OD490 nm)。

1.5 Transwell 小室实验

P3代细胞接种前无血清培养12 h后，消化细胞，用含FBS培养基(0.1%)调整细胞密度为2×105个/mL，取200 μL细胞悬液加入Transwell小室的上室，培养箱培养2 h后，下室加入750 μL含或不含杯苋甾酮(5、10、20 μg/mL)的FBS培养基(20%)，每组设3个复孔。培养箱中培养10 h后，取出小室，弃孔中培养液，PBS洗2遍，4%多聚甲醛固定20 min，PBS洗2遍，吉姆萨染液染色20 min，PBS洗2遍，在倒置显微镜(×400)下，随机取5个视野，观察计数细胞。

1.6 PCR法检测CXCR4表达

采用Primer5 软件，根据NCBI上下载的CXCR4 基因下载的序列设计引物和探针，核苷酸序列和扩增片段长度，见表1。荧光定量PCR体系及反应条件。P3代细胞消化后接种于12孔板中，分别给予浓度为5、10、20 μg/mL及0 μg/mL(空白对照组)的杯苋甾酮处理。处理后，裂解细胞，采用Trizol 法提取总RNA，PCR反应采用一步法进行扩增，扩增体系体积为50 μL，包含1×suPerscrPt buffer，引物(各8 Pmol)，荧光探针(各4 Pmol)，5 μL RNA 模板。扩增反应条件为：50 ℃ 15 min，94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s 共50个循环。RNA操作严格按照说明书步骤进行。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.7 进一步验证SDF-1/CXCR4 信号轴在杯苋甾酮干预BMSCs迁移中的作用

1.7.1Transwell 小室实验：运用siRNA CXCR4的沉默质粒转染BMSCs，干预24 h(12 h)后，消化细胞，分为空白对照组、CXCR4沉默组、杯苋甾酮组、杯苋甾酮+CXCR4沉默组，进行 Transwell 体外实验(方法同1.5)，其中杯苋甾酮组：含杯苋甾酮10 μg/mL的20%FBS培养基；CXCR4沉默组：单纯予以siRNA CXCR4转染BMSCs；杯苋甾酮+CXCR4沉默组：CXCR4沉默质粒转染BMSCs，同时予以含杯苋甾酮10 μg/mL的20%FBS培养基。余实验步骤同上1.6。CXCR4-Rat-365：sense：序列(5′-3′)GACUGGUACUUUGGGAAAUTT；antisense：序列(5′-3′)AUUUCCCAAAGUACCAGUCTT。

1.7.2免疫蛋白印迹法(Western blot)检测CXCR4蛋白表达：运用siRNA CXCR4的沉默质粒转染BMSCs，干预24 h后，消化细胞并接种于6孔板中，按空白对照组、CXCR4沉默组、杯苋甾酮组、杯苋甾酮+CXCR4沉默组分别处理。将各组细胞裂解，提取总蛋白，加入5×SDS溶液煮沸变性。用微量进样器吸取各组30 μL样品蛋白加入浓缩胶样品孔中并电泳20 min(100 V)，分离胶中电泳 40 min(200 V)，转膜 70 min(350 mA)。膜室温封闭 1 h；将膜取出放入GAPDH、CXCR4 一抗(1∶1000)中，4 ℃反应过夜；PBST洗膜，5 min×4次；将膜转入二抗(1∶30 000)中，37 ℃反应1 h；PBST 洗膜，5 min×5次；用化学发光法显影。Image J图像处理软件分析，结果以CXCR4/GAPDH比值表示。

2 结果

2.1 不同浓度杯苋甾酮干预MTT细胞增殖实验

结果显示，杯苋甾酮10、20 μg/mL对BMSCs均有显著的增殖作用，与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)，且以10 μg/mL浓度的效果最佳(P<0.05)。见图1。

图1 不同浓度杯苋甾酮干预MTT细胞增殖实验结果Fig.1 Results of MTT cell proliferation experiment with different concentrations of cyasterone注：与空白组比较，*P<0.05；与10μg/mL组比较，△P<0.05。

2.2 不同浓度杯苋甾酮促进BMSCs体外迁移实验

结果显示，与空白组对比，杯苋甾酮5、10、20 μg/mL均促进细胞迁移(P<0.05)，且以10 μg/mL浓度的效果最佳(P<0.05)。见图2、3。

图2 不同浓度杯苋甾酮促进BMSCs体外迁移结果Fig.2 Different concentrations of cyasterone to promote the migration of BMSCs in vitro注：与空白组比较，*P<0.05；与10 μg/mL组比较，*△P<0.05。

图3 不同浓度杯苋甾酮干预后各组显微镜下细胞情况 A：空白对照组(×400)；B：杯苋甾酮5 μg/mL组(×400)；C：杯苋甾酮10 μg/mL组(×400)；D：杯苋甾酮20 μg/mL组(×400)。Fig.3 Cellular conditions of each group after intervention with different concentrations of cyasterone. A: Blank control group (×400); B: Cyasterone 5 μg/mL group (×400); C: Cyasterone 10 μg/mL group (×400); D: Cyasterone 20 μg/mL group (×400).

2.3 不同浓度杯苋甾酮干预 CXCR4表达

PCR结果显示，杯苋甾酮5、10、20 μg/mL均促进 CXCR4表达(P<0.05)，且呈浓度依赖性，以10 μg/mL浓度的效果最佳(P<0.05)，与 Transwell 结果相对吻合(见图4)。

图4 不同浓度杯苋甾酮干预 CXCR4表达结果Fig.4 CXCR4 expression results under different concentrations of cyasterone intervention注：与空白组比较，*P<0.05；与10 μg/mL组比较，△P<0.05。

2.4 进一步验证SDF-1/CXCR4 信号轴在杯苋甾酮干预BMSCs迁移中的作用

2.4.1各组Transwell 结果：与空白组对比，CXCR4沉默组抑制细胞迁移(P<0.05)；相反，杯苋甾酮组则促进细胞迁移(P<0.05)。另外，CXCR4沉默+杯苋甾酮组则与空白组对比差异无统计学意义(P>0.05)。见图5、6。

图5 各组Transwell 结果Fig.5 Transwell results for each group注：与空白组比较，*P<0.05；与CXCR4沉默组比较，△P<0.05。

图6 各组显微镜下细胞情况 A：空白对照组(×400)；B：CXCR4沉默组(×400)；C：杯苋甾酮组(×400)；D：CXCR4沉默组+杯苋甾酮组(×400)。Fig.6 Cell conditions of each group under microscope. A: Blank control group (×400); B: CXCR4 silencing group (×400); C: Cyasterone group (×400); D: CXCR4 silencing group + Cyasterone group (×400).

2.4.2各组干预后CXCR4蛋白表达：Western blot结果显示，与空白组对比，CXCR4沉默组均抑制 CXCR4 蛋白表达(P<0.05)；相反，杯苋甾酮组则促进CXCR4 蛋白表达(P<0.05)。另外，CXCR4沉默+杯苋甾酮组则与空白组对比差异无统计学意义(P>0.05)。见图7。

图7 各组中CXCR4表达凝胶电泳图Fig.7 Electrophoresis of CXCR4 expression in each group

3 讨论

中医学认为“血不活则骨不能接”“瘀不去则骨不能接”，治疗骨折“补肾是基础，活血是关键”[9]；而“损伤一症，专从血论”“活血祛瘀法”当贯穿骨折治疗的始终[10]。“肝主筋、肾主骨”，中医治疗骨折与大部分药物选用归肝、肾经为主的中药，取其活血化瘀、和血调营、补肾强筋的功效[11-12]。之前活血化瘀药促进骨折愈合机理主要在局部血液循环、成骨细胞活性和分化等方面研究[13-14]，而促进BMSCs迁移归巢的研究较少。近年来发现，具有活血止痛中药的有效成分可促进外源性骨髓BMSCs在体内的迁移，不仅可使损伤部位的骨髓BMSCs数量增加，且局部的干细胞因子和趋化因子表达水平明显增加[15]。这提示具有归肝、肾二经的活血化瘀中药具有促进BMSCs归巢至骨折端，并促进骨折愈合的作用。笔者的前期研究发现，补肾活血法在促进BMSCs迁移中具有重要作用，其相关机制与激活SDF-1/CXCR4信号轴有关[16-17]。

在骨折愈合的早期炎症阶段，血管和其它组织破坏导致组织和低氧，这个过程触发炎症联级反应[18]，诱导一些细胞因子(如IL-6)和趋化因子(如基质细胞洐生因子，stromal cell-derived factor-1，SDF-1，又称CXCL12)等分泌，促使BMSCs从骨膜和骨髓中释放进入血液中，迅速聚集到骨折部位，启动骨再生过程[19]。SDF-1与其配体CXCR4具有高度亲和力，是诱导干细胞趋化和归巢相关分子中最重要的信号轴之一，在受伤的骨膜中升高，召募BMSCs到骨折位置，提高软骨内成骨[20-21]。Kitaori等[22]的研究发现，骨折损伤时SDF-1可从骨膜中诱导出、与CXCR4结合，从而募集 BMSCs至损伤部位，促进骨折修复。运用移植的BMSCs联合局部注射SDF-1能修复骨不连，并呈剂量依赖性[23]。SDF-1与受体CXCR4的结合在受抑制时骨折后软骨、骨痂及骨矿化的量明显影响较少[24]。川牛膝具有活血通经、补益肝肾、祛瘀止痛、强筋健骨的功效，在治疗骨折的常用活血化瘀中药中使用频率较高。以往大量的临床和实验表明，杯苋甾酮作为川牛膝的提取、分离的化学成分之一，在治疗骨质疏松症中具有抑制破骨分化和促进成骨分化的双向作用[25]。但其激发干细胞迁移，进而促进骨折修复尚未见研究报道。

本研究运用MTT、Transwell体外迁移实验筛选杯苋甾酮动员BMSCs归巢的最佳浓度为10 μg/mL。PCR结果显示，杯苋甾酮5、10、20 μg/mL均促进CXCR4表达(P<0.05)，且以10 μg/mL浓度的效果最佳(P<0.05)，与 Transwell 结果相对吻合。为进一步证实杯苋甾酮是否通过上调CXCR4蛋白来促进BMSCs体外迁移的作用，本实验中运用CXCR4沉默质粒干预 BMSCs，结果显示，与空白组对比，CXCR4沉默组抑制细胞迁移(P<0.05)；相反，杯苋甾酮组则激发细胞迁移能力(P<0.05)，而CXCR4沉默+杯苋甾酮组则与空白组对比差异无统计学意义(P>0.05)。另外，蛋白印迹结果显示CXCR4表达结果与迁移结果一致。说明杯苋甾酮在促进BMSCs体外迁移的作用机制主要是通过上调CXCR4这一靶点来实现的，这可能与激活SDF-1/CXCR4 信号轴有关，但其内在机制尚待进一步探究。本研究结果为杯苋甾酮作为加快骨折愈合、缩短骨折愈合时间以及防止骨折延迟愈合及骨不连的辅助治疗提供理论依据，间接阐明中医活血法在骨折愈合中的治疗作用。