UPLC-MS对骨质疏松症阴虚证临床代谢标志物筛查研究

尹恒 王建伟 张亚峰 马勇 朱庭辰 陈浩 王高祥 笪巍伟 苏秋菊

1.南京中医药大学无锡附属医院，江苏 无锡 214071 2.南京中医药大学，江苏 南京 210038 3.扬州市中医院，江苏 扬州 225009 4.南京医科大学附属无锡人民医院，江苏 无锡 214023

原发性骨质疏松症(osteoporosis，OP)是多种原因引起的一种以骨组织含量减少、骨的微观结构退化为特征的，致使骨的脆性增加、强度降低而导致易于发生骨折的一种全身性骨骼疾病，属于一种骨代谢性疾病[1]。OP具有高发病率、高致残率、致死率的特征，已经给世界各国老年人群的健康带来了严重影响。早期诊治OP非常重要。中医药治疗OP疗效确切，但缺乏分子机制方面的深入研究。代谢组学是系统生物学的重要组成部分[2]，可直观、全面地反映生物体内的代谢物变化，其综合、系统、动态等分析特性与中医的整体、辨证、恒动等观念具有微妙的一致性，能为OP的中医诊疗提供新的思路和方法。本研究尝试运用UPLC-MS技术，检测肝肾阴虚证OP患者的血清代谢物，通过统计学方法筛查差异代谢物，期望将筛查所得差异代谢物与中医证型相关联，并将结果应用于后续的诊断和治疗研究中。

1 材料和方法

1.1 病例来源

筛选2019年4月至2020年8月在南京中医药大学无锡附属医院骨伤科、无锡市人民医院针灸科门诊就诊的符合“肝肾阴虚证”的原发性骨质疏松症患者[3]。纳入女性骨质疏松症肝肾阴虚证患者30例作为肝肾阴虚组(I组)，非骨质疏松女性30例作为对照组(CK组)。所有受试者均取得知情同意。

1.2 病例诊断标准

1.2.1西医诊断标准[4]：满足其中任何一项均可诊断，①髋部或椎体脆性骨折；②DXA测量的中轴骨骨密度或桡骨远端1/3骨密度的T值 ≤-2.5；③骨密度测量符合低骨量(-2.5 < T值 <-1.0)+肱骨近端、骨盆或前臂远端脆性骨折。

1.2.2中医辨证分型标准[3]：中医辨证分型标准来自《中医药防治原发性骨质疏松症专家共识(2015)》[5]，选取肝肾阴虚证患者开展研究。主症：腰膝酸痛，手足心热。次症：下肢抽筋，驼背弯腰，两目干涩，形体消瘦，眩晕耳鸣，潮热盗汗，失眠多梦，舌红少苔，脉搏细数等。

1.3 纳入标准

①符合原发性骨质疏松症中西医诊断标准者；②辨证为肝肾阴虚证者；③自愿接受试验，并签署知情同意书者；④临床相关资料相对完整者；⑤绝经后女性；⑥年龄55～85岁。

1.4 排除标准

①可能影响体内骨代谢的内分泌疾病、免疫性疾病、恶性肿瘤；长期服用糖皮质激素或其他影响骨代谢的药物者；②伴有严重心、脑、肝、肾等脏器疾病，控制不佳者，或常规化验检查主要指标严重异常者(超过上限1.5倍)；具有急慢性的炎症性疾病或传染性疾病者；③非第一次做相关研究者；④有酒精、药物滥用史者。

1.5 伦理审批

本项目经南京中医药大学无锡附属医院医学伦理委员会批准同意实施(编号：SWJZH2019112101)。

1.6 研究方法

1.6.1实验分组及样本量：本研究纳入女性骨质疏松症肝肾阴虚证患者30例作为肝肾阴虚组(I组)，非骨质疏松女性30例作为对照组(CK组)。

1.6.2一般资料：记录患者门诊号、性别、一般生命体征、现病史、既往史等常规病历资料。提取资料中患者中医症候、年龄、身高、体重、体质量指数(BMI)等资料用于后续统计分析。

血常规、肝功能、肾功能、电解质检测，用于评估患者基本健康情况。

采用双能X线骨密度仪(DXA，美国LUNA公司)测定腰椎骨密度。

本研究代谢组学检测部分由上海鹿明生物科技有限公司完成。

采集患者空腹静脉血5 mL，静置、离心后，-80 ℃冰箱储存备用。

1.6.3主要仪器：使用高效液相色谱-质谱(UPLC-MS)技术进行代谢组学检测、分析。主要仪器包括：漩涡振荡器TYXH-I、超声波清洗机SB-5200DT、台式高速冷冻离心机TGL-16 MS、高效液相色谱仪ACQUITY UPLC、高分辨质谱仪QE、色谱柱ACQUITY UPLC BEH C18等。

1.6.4样本预处理：将-80 ℃下保存的样本取出，解冻，移取100 μL血清，加入内标各10 μL，震荡10 s；加入300 μL的蛋白沉淀剂，涡旋震荡1 min；超声提取10 min；-20 ℃下静置30 min；离心10 min ，取300 μL上清液挥干，然后用400 μL甲醇-水复溶，涡旋30 s，超声2 min。离心10 min，吸取150 μL的上清液，过滤后，转移到LC进样小瓶，-80 ℃下保存，准备LC- MS分析。

色谱条件：色谱柱柱温：40 ℃；流速为：0.35 mL/min；流动相：A-水(含0.1 %甲酸)，B-乙腈(含0.1 %甲酸)。每个样本的进样体积均为5 μL。每10个标本中插入一个QC样本。

质谱条件：利用质谱仪采集色谱柱洗脱物。离子源：ESI；采用正负离子扫描模式。

1.7 统计学处理

统计采用SPSS 22.0、R、SIMCA-P等统计软件。采用独立样本t检验/F检验方法；以P< 0.05为差异有统计学意义。

代谢组学原始数据经Progenesis QI v2.3软件进行基线过滤、峰识别、积分、保留时间校正、峰对齐和归一化，导入SIMCA-P11.5软件进行主成分分析(PCA)、有监督的偏最小二乘法分析(PLS-DA)及正交偏最小二乘法分析(OPLS-DA)，用于区分组间代谢物的总体差异；所得得分矢量图(score plot) 用以获得样品分类信息，载荷矢量图(loading plot)用于筛选差异性代谢分子。

2 结果

2.1 一般资料

本研究共收集60例受试者血清资料，I组、CK组各30例，各组受试者年龄分布、BMI、BMD等基线资料情况。两组受试者的BMD差异具有统计学意义(P<0.05)；年龄、BMI差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 纳入患者的基线资料Table 1 Baseline data of included patients

2.2 血清代谢组学分析

2.2.1基峰图：BPC(base peak chromatogram，基峰图)是将每个时间点质谱图中最强的离子的强度连续描绘得到的图谱。正负离子模式的BPC图见图1，图2。

图1 样本I1基峰图-阴离子模式Fig.1 Base peak diagram of sample I1-anion mode

图2 样本I1基峰图-阳离子模式Fig.2 Base peak diagram of sample I1-cationic pattern

2.2.2多元统计分析：共鉴定出15 671个离子。采用PCA来观察各样本之间的总体分布以及整个分析过程的稳定性，然后用PLS-DA、OPLS-DA及OPLS-DA模型的响应排序检验、Loading-OPLS-DA来区分组间代谢轮廓的总体差异，分析组间的差异代谢物，建立数据矩阵。示意图如图3。

图3 多元统计分析PCA、OPLS-DA示意图Fig.3 Diagram of multivariate statistical analysis of PCA and OPLS-DA OPLS-DA(I-CK)

2.2.3单变量统计分析：下一步进行单变量统计分析，计算上述数据矩阵的P值和Fold change值。利用火山图对所得数据进行可视化，如图4所示，其中红点为在I组中显著上调的差异代谢产物，蓝点为I组显著下调的差异代谢产物，灰点为不显著的差异代谢产物，P=0.05。

图4 单变量统计火山图Fig.4 Univariate statistical volcano map

2.2.4差异代谢物热图：采用多维分析和单维分析相结合的办法，来筛选组间差异代谢产物。筛选标准为OPLS-DA模型第一主成分的VIP值>1，T检验的P值<0.05。I-CK差异代谢物418个。见图5。

注：左 全部差异代谢物；右 Top50。图5 I-CK组热图Fig.5 Heat map of I-CK group

2.2.5二次筛选：以上步骤筛选出的差异代谢物较多，且部分差异代谢物二级碎片评分为0，部分代谢产物无法归类，物质鉴定较为困难。为便于分析鉴定，我们采取更加严格的筛选标准，期望筛选出更有意义的差异代谢物。

筛选标准：①VIP > 1；②P<0.05；③log2(FC) > 1 或者 < -1；④Fragment score0。

2.2.6筛选出的差异性代谢物的鉴定：按照上述筛选标准，结合HMDB、Lipidmaps(v2.3)、METLIN数据库提供的代谢物的具体定性信息，鉴定潜在的生物标志物。共筛选出15个肝肾阴虚证差异性代谢物(表2)。绘制成热图如图6所示。

图6 骨质疏松症阴虚证的潜在代谢标志物热图Fig.6 Heat map of potential metabolic markers of Yin deficiency syndrome in osteoporosis

表2 筛选出的15个骨质疏松症阴虚证差异性代谢物Table 2 Screening out 15 different metabolites of Yin deficiency syndrome in osteoporosis

2.2.7KEGG代谢通路富集分析：通过对上述差异代谢物进行KEGG信号通路富集分析，得到结果如图7所示。

图7 骨质疏松症阴虚证差异代谢物KEGG信号通路富集分析Fig.7 Enrichment analysis of KEGG signaling pathway of different metabolites in Yin deficiency syndrome of osteoporosis

2.3 差异代谢物与临床资料的相关性分析

将筛选出来的15个差异代谢物与年龄、BMD、BMI资料进行线性相关分析，并绘制相关矩阵(图8)。从该图中可以看出：年龄与BMD、Tetrahydropentoxyline、N-(1-Deoxy-1-fructosyl)valine等多项代谢指标呈负相关(P<0.05)，BMD与15-O-Demethyl-10,29-dideoxy-11,12-dihydro-striatin C、LysoPE(18∶2(9Z,12Z)/0∶0)等代谢指标呈负相关(P<0.05)。BMI与各项代谢指标相关性较弱(P>0.05)。

图8 骨质疏松症阴虚证差异代谢物与临床资料相关性矩阵Fig.8 Correlation matrix between different metabolites and clinical data in Yin deficiency syndrome of osteoporosis

3 讨论

原发性骨质疏松症是一种最普遍的代谢性骨骼疾病，与中医典籍中所描述“骨痿”“骨痹”等疾病范畴接近[6]。《素问·痿论》描述：“……肾气热，则腰脊不举，骨枯而髓减，故足不任身，发为骨痿”；《素问·长刺节论》关于“骨痹”的描述：“……病在骨，骨重不可举，骨髓酸痛，寒气至，名曰骨痹。”中医认为，多个脏腑的功能失调都可能导致骨质疏松，其病机主要是本虚标实，其中最典型的是肾、脾、肝的虚损以及瘀血阻络。在治法上，中医主张补肾、固本、填精、养血、助阳、益气，强调标本同治，注重整体调节[7]。《中医药防治原发性骨质疏松症专家共识2015》[4]将原发性骨质疏松症辨证分为肾阳虚证、肝肾阴虚证、脾肾阳虚证、肾虚血瘀证、脾胃虚弱证和血瘀气滞证。其中肝肾阴虚证主症为：腰膝酸痛，手足心热。次症为：下肢抽筋，驼背弯腰，两目干涩，形体消瘦，眩晕耳鸣，潮热盗汗，失眠多梦，舌红少苔，脉搏细数等。笪巍伟等[8]的临床流行病学调查数据中发现，肝肾阴虚型骨质疏松症较为常见。因此我们选择肝肾阴虚证型开展代谢组学研究。

长期以来，中医药的临床研究存在如下问题[9]：①难以确立基于证型的客观标准，使中医证型无法被国际广泛认可；②缺乏量化指标，导致中医证型无法进行数据探索。这些问题在中医药研究领域广泛存在，阻碍了中医学研究的现代化、国际化，因此我们需要尝试将传统中医药理论与现代科技相结合，在全新的领域开展研究，期望有更多有意义的发现。

中医理论中，“证”是疾病发生过程中，对疾病所处阶段、病因、病机的高度概括。“证”既包括疾病的临床表现，又涵盖了疾病的病理机制。我们认为，“证”的表现应该存在一定的物质基础。在骨质疏松症研究领域，前期中医药研究者已尝试从基因组水平开展了中医“证”的物质基础研究[10-11]，也进行了基于代谢组学的动物实验[12]，但基于临床证型资料的代谢组学研究尚未见报道。

代谢组学目前定义为定量测量生物系统全部代谢物组成以及代谢物在内外刺激下动态改变的科学。代谢组学能够通过代谢产物的变化，实时监控内外源性扰动带来的机体代谢物质及功能变化，目前已被广泛应用于各类代谢性疾病的研究之中[13-14]。代谢组学的突出特点为整体性、动态性、即时性，与中医的“整体观”、“恒动观”不谋而合，因此将代谢组学引入中医药研究领域可能会有新的有意义的发现。

3.1 阴虚证原发性骨质疏松症的差异代谢物组成

在本研究中，我们选取了两组受试者进行血清代谢组学检测，通过差异性分析，筛选潜在的差异代谢物，用于后期诊断和治疗评价。研究结果发现，两组受试者的15个内源性代谢产物具有较为显著的差异。根据差异性代谢物归类表，可将本研究所得到的差异代谢物归类为：氨基酸类：苯丙氨酸、甘氨胆酸、氨基吡唑基丙酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸，共计6个；生物碱类：茶碱，骆驼蓬总碱，2个；胆红素类：胆红素，(4E，15Z)-胆红素，2个；磷脂类：溶血磷脂酰乙醇胺，1个；恶唑类：2-甲基-4-戊氯恶唑，1个；酚酯类：二苯氧苯胺，1个；低聚肽类：乳基谷胱甘肽，1个；二萜类：15-O DC，1个。可见氨基酸类代谢物在阴虚型骨质疏松症差异代谢物中具有较大占比。有意思的是，我们在另一项研究中发现，阳虚型骨质疏松症的差异代谢物大部分却是脂类。

3.2 阴虚证原发性骨质疏松症与氨基酸代谢

氨基酸是组成生物功能大分子蛋白质发挥生物学功能的基本单位，主要参与蛋白质的合成与代谢。氨基酸主要是以Embden-Meyerhof途径与柠檬酸循环的中间物为碳链骨架进行生物合成，其分解代谢流程一般是先脱去氨基，形成碳骨架，随后可以被氧化成CO2和H2O产生ATP，也可以为糖或者脂肪酸的合成提供碳架[11]。氨基酸参与一系列的生理学过程，如调节渗透压、维持细胞膜稳定、调节钙流动、神经系统发育、抗氧化等。在调节骨代谢方面的研究表明，氨基酸可以作为骨骼和钙的直接调节剂[15]。

Bihuniak等[16]的研究表明多种氨基酸对肠道、成骨细胞、破骨细胞和GH/IGF-1轴有着直接或间接影响。在体内，Lys、Arg能够增强肠内钙的吸收，增加ALP、PICP、NO分泌，降低体外成骨细胞IL-6的生成，从而导致骨胶原合成和骨形成增加，骨吸收减少。在体外Lys可促进成骨细胞增殖，减少成骨细胞IL-6的分泌。Arg能够降低IL-6的生成，刺激GH分泌，导致IGF-1循环水平的上升，促进的成骨细胞合成代谢。His和Phe能够共同增加体内循环IGF-1水平。在体外Phe、Tyr和Trp的不同组合能够降低破骨细胞中Vitronectin受体的表达，从而降低破骨细胞前体的附着。氨基酸能够诱导增加钙吸收效率、成骨细胞增殖和骨矿化、I型胶原的合成和IGF-1循环水平，减少骨吸收、抑制破骨细胞附着和破骨细胞分化，能够导致骨量的净增加。Necat等[17]的研究表明，Hcy能够通过影响绝经后妇女破骨细胞的抗氧化能力，而改变骨矿密度。

在本研究中，我们发现阴虚证原发性骨质疏松症患者血清中，6种氨基酸含量发生了显著变化。在基本饮食谱无明显差异的情况下，我们推测这些氨基酸更可能来自体内分解代谢的差异。一种可能是阴虚证异常的代谢状态对能量的需求不同，使得氨基酸代谢发生了改变；另一种可能是在某种代谢通路的变化后，氨基酸代谢发生了改变，产生了差异性的血清氨基酸水平，影响机体各个系统最终表现出腰膝酸软、潮热盗汗、目涩昏花、舌红少苔、脉搏细数等肝肾阴虚证的典型临床表现。再回顾中医治疗阴虚证的几个经典方剂，如左归丸[18-19]、大补阴丸[20]、一贯煎等，均含有龟板等血肉有情之品，也就是动物组织蛋白质、氨基酸，是否从另一个角度验证了补充氨基酸治疗阴虚证的有效性，这些都值得深入研究。

4 总结

本研究利用临床血清样本筛查了肝肾阴虚证骨质疏松症的差异代谢物，作为潜在的骨质疏松症生物标志物，下一步可将这些差异代谢物与临床症状、骨密度进行关联性分析，建立基于血清代谢物的骨质疏松症模型并验证，用于指导临床诊断。也可以监测用药前后机体代谢分子的变化来研究药物对骨质疏松症的代谢方面扰动作用机制。代谢组学在中医药治疗骨质疏松症研究方面具有广阔的发展前景，并能够进行深入的机制探索，值得推广开展。同时也应该清楚地认识到，在中医整体观念指导下，单纯利用代谢组学方法对“证”研究是不够全面的，需要将多组学有机地结合起来，使中医药研究更加系统和规范[21]。