HIF-1α在骨血管及骨代谢方面与骨质疏松症相关性研究进展

王世浩 陈桐莹 赵宇 刘树华 万雷

1．广州中医药大学第三临床医学院，广东 广州 510405 2．广州中医药大学第三附属医院，广东 广州 510375

骨质疏松症的流行病学和发病机制研究显示，除雌激素的缺乏外，衰老和相关的活性氧(reactive oxygen species , ROS)升高也是诱发骨质疏松症的重要原因[1]，有研究[2]证明低氧是保护骨骼免受ROS介导损害的关键因素，而骨骼和骨髓腔处于天然的低氧状态[3]。低氧作为一种常见的特征性微环境，与生命活动息息相关，同时也与众多疾病的发生和发展有着千丝万缕的联系，这些疾病包括心血管疾病、阻塞性肺炎、肿瘤、骨代谢、炎症等。近年来研究表明，维持骨稳态的成骨细胞和破骨细胞均属于氧感应细胞[4]，低氧在参与调控骨重建和骨转换的过程中发挥着重要作用[5]。缺氧诱导因子-1(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)是具有转录活性的核蛋白，在缺氧环境下稳定表达，具有相当广泛的靶基因谱，主要由120 kD的HIF-1α和91～94 kD的HIF-1β两个亚单位组成[6]，其中HIF-1α是HIF-1的活性亚基，对氧气十分敏感[7]，是重要的缺氧调控因子，有研究[8-9]证明HIF-1α对原发性和继发性骨质疏松的治疗发挥着重要作用。故本文就HIF-1α在骨血管及骨代谢方面的作用对骨质疏松症发生发展的影响及防治进行综述。

1 HIF-1α的基本结构与生物特性

HIF-1α和HIF-1β构成HIF-1，其中HIF-1α的基因定位于人的14号染色体q21～24区，受缺氧信号调控；而HIF-1β的基因位于人的1号染色体q21区，又称芳香烃受体核转运子(ARNT)，起结构性作用[10]。HIF-1α由氧依赖降解结构域(oxygen-dependent degradation domain，ODDD)和两个反式激活结构域(TAD-N和TAD-C)组成[11]，这些结构域都是缺氧诱导蛋白稳定、核定位和转录激活的调节域。

HIF-1α几乎在所有类型的细胞中都有表达[12]，在常氧状态下，HIF-1α上的脯氨酸残基被脯氨酸羟化酶(PHD)羟基化[13]，这使得它可以被Von Hippel-Lindau蛋白(VHL)识别[14]，从而进行随后的多泛素化和降解[15]。在低氧条件下，PHD的活性被抑制，阻止了HIF-1α的羟基化，导致HIF-1α在细胞质中积累并与HIF-1β结合形成二聚体，随后被转移到细胞核，在那里它与调节区的缺氧反应元件(HRE)结合[16]，导致其下游靶基因的激活，进而诱导对缺氧的反应，包括糖酵解、红细胞生成、血管生成、细胞增殖和凋亡等过程。见图1。

图1 HIF-1α氧调控示意图Fig.1 Schematic diagram of HIF-1α oxygen regulation

2 HIF-1α在骨血管及骨代谢方面对骨质疏松症的作用

2.1 HIF-1α调节骨血管作用

骨骼是有着丰富血管的组织，在骨发育过程中，骨组织的血管化具有非常重要的作用。除了已被广泛认知的骨膜表面血管外，Ritchlin等[17]首先在小鼠体内发现了一种跨皮层血管，这种血管在人体内同样存在，说明在骨骼中有着比我们现有认知更加庞大而精密的血管网络。

骨血管是骨质疏松症研究中不可忽视的重要领域，丰富的骨血管是成骨细胞和破骨细胞生长分化的关键，血液不仅提供养分，同时也提供骨形成所必需的氧，当骨血管灌注不足时，骨组织就会形成低氧环境，从而诱导HIF-1α的稳定表达，而HIF-1α可通过调节OASIS蛋白、miRNA-675-5p等影响骨血管形成。

内质网(ER)应激传感器OASIS是一种碱性亮氨酸拉链(bZIP)转录因子，它是CREB/ATF家族的成员，在骨形成中发挥着重要作用[18]，Cui等[19]在实验中发现，OASIS-HIF-1α复合物可能在骨骼发育和血管生成中起重要作用。OASIS与HIF-1α的相互作用影响HIF-1α靶基因的表达，血管内皮生长因子A(VEGFA)在OASIS缺陷型小鼠胚胎成纤维细胞中的表达水平显著降低，同时血管生成受阻。Costa等[20]研究发现常氧状态下，HIF-1α被泛素化可调高miRNA-675-5p的表达，从而促进了MSC标记(CD44、CD90和CD73)的下调，在低氧条件下HIF-1α的堆积会调低miRNA-675-5p的表达，进一步促进血管生成，以及恢复MSC的表型。HIF-1α可能通过miRNA-675-5P调节骨血管生成以及间充质干细胞的成骨的作用。

2.2 HIF-1α调节骨代谢

2.2.1HIF-1α调节成骨细胞作用：成骨细胞可分泌骨胶原和骨基质，是参与骨形成的主要功能细胞，低氧环境下，HIF-1α稳定表达，ALP、Runx2、骨钙蛋白等成骨标志物显著上调，表明成骨细胞增殖和分化作用增强。HIF-1α可通过对VEGF、IL-6、IL-8、Foxo1、VHL以及miRNA-497～195簇等的调控作用进而调节成骨细胞生成。

低氧环境下，骨组织内HIF-1α的表达增加，可上调VEGF，成骨细胞内含VEGF受体(VEGFR-1、VEGFR-2等)，VEGF 与其受体结合，可增强成骨细胞移动和分化功能[21]，即HIF-1α可上调VEGF来增强成骨细胞的分化和活性。除了VEGF外，Niu等[22]发现缺氧条件下，随着HIF-1α的上调，IL-6和IL-8的表达也被上调，表明低氧条件下HIF-1α的过表达显著增加了成骨细胞中IL-6和IL-8的水平，而IL-6和IL-8可以显著促进人成骨细胞的增殖。

Foxo1是Foxo家族中最早和最具代表性的成员之一，它在许多生理和病理过程中起着重要作用，包括增殖、凋亡、吞噬作用、新陈代谢、炎症、分化和氧化应激，Foxo1还是成骨细胞增殖和维持人体氧化还原平衡所需的转录因子。Xu[23]使用从儿童松质骨获得的成骨细胞，在敲低HIF-1α后，明显增加了细胞中的活性氧水平和凋亡，而HIF-1α的过表达刺激了细胞活力，也增加了Foxo1的转录和翻译水平，沉默HIF-1α会明显抑制细胞活力及Foxo1的表达水平。此外，沉默HIF-1α会降低成骨标志物(包括Runx2、ALP和骨钙蛋白)的表达，而Foxo1(siRNA)明显逆转了HIF1α诱导的Runx2和ALP表达，但Foxo1(siRNA)对骨钙素的影响不明显。因此HIF-1α和Foxo1的相互作用参与了成骨细胞标志物的调控，并在成骨细胞的增殖和凋亡中起关键作用。

Shao等[24]通过条件性删除von Hippel-Lindau(VHL)基因，HIF-1α在成熟成骨细胞中的过表达将显著增加血管生成和成骨作用，成骨细胞缺乏VHL的小鼠具有高水平的HIF-1α，并增加了骨质量和密度。而HIF-1α条件性基因敲除小鼠的骨量和骨密度降低，研究还表明破骨细胞活性的必要调节剂骨保护素(OPG)可以被HIF-1α上调，进而下调破骨细胞的吸收活性，因此HIF-1α可能直接结合到OPG的上游位点并增强其表达，进而干扰成骨细胞和破骨细胞的骨耦合。

miRNA是一种非编码小分子RNA，是重要的转录后调控因子，HIF-1α也可通过miRNA进而调节成骨细胞作用。Yang等[25]发现miRNA-497～195簇的过表达会上调HIF-1α水平，而miRNA-497～195簇在CD31hiEmcnhi内皮细胞中高表达，CD31和内粘蛋白(CD31hiEmcnhi)为血管生成与成骨的耦合的特定骨血管亚型，对骨形成有重要作用。在内皮细胞中敲低了miRNA-497～195的小鼠显示出较少的CD31hiEmcnhi血管和较低的骨量，而miRNA-497～195在小鼠基因中的过表达则会逆转该现象。

2.2.2HIF-1α调节破骨细胞作用：现有研究已证实在破骨细胞分化调节中肿瘤坏死因子受体家族的 NF-κB 受体活化因子配体(RANKL) 和骨保护素(OPG)起着重要的作用。RANKL与破骨细胞的核因子κB受体活化因子( receptor activator of NF-κB，RANK) 结合，激活细胞内信号传导系统，刺激破骨细胞分化增殖，使骨吸收增加，骨量丢失；OPG可与RANKL结合，竞争性阻断RANKL与RANK 的结合，从而抑制前体破骨细胞的分化和融合，抑制成熟破骨细胞的功能，诱导其凋亡[26]。

HIF-1α可通过OPG / RANK / RANKL、JAK2 / STAT3等多种信号通路直接或者间接产生对破骨细胞分化和吸收活性作用，但是其具体影响因素和机制还有待明确。破骨细胞作为防治骨质疏松症的重要切入点，HIF-1α对破骨细胞作用的研究是具有重要意义的。

Shao等[24]发现HIF-1α可通过上调破骨细胞活性的必要调节剂骨保护素(OPG)，进而抑制破骨细胞活性。Shi等[27]研究同样发现低氧环境下，HIF-1α的可增加hMSCs中OPG的表达增加，并降低RANKL表达，增加OPG / RANKL比，显著促进成骨分化。而Kang等[28]发现HIF-1α除了上调OPG，还可以刺激白介素33(IL-33)表达增加，从而抑制破骨细胞生成。HIF-1α通过结合IL-33上的-1 504/-1 500 bp促进IL-33表达启动子，IL-33作用于骨髓来源的单核细胞(BMM)，以减少其破骨细胞分化。但是Zhu等[29]的研究表明在缺氧条件下，上调的HIF-1α促进了RANKL的形成，从而促进破骨细胞的形成，RANKL的表达随缺氧持续时间先升高后降低，该表达在24 h达到峰值。这与Knowles等[30]的观点一致，其证实破骨细胞在低氧分化过程中需要复氧，如果持续暴露在缺氧下，由于细胞的广泛死亡，会明显抑制破骨细胞的形成和骨吸收功能。缺氧下HIF-1α的稳定表达可通过上调RANKL来促进破骨细胞的形成，其结论与Shi等[27]实验结论相悖，可见HIF-1α调控破骨细胞的具体机制以及影响因素还有待进一步研究。

Zhu等[31]在另一个研究中发现HIF-1α通过激活MLO-Y4细胞中的JAK2 / STAT3通路来促进RANKL的表达，从而影响破骨细胞的生成。在缺氧条件下，JAK2抑制剂AG490抑制了p-JAK2、p-STAT3和RANKL表达，即AG490可能通过JAK2 / STAT3通路干扰了HIF-1α对RANKL的调节，从而影响破骨细胞的生成。Hulley等[32]研究发现HIF-1α siRNA仅适度影响破骨细胞的分化，通过抑制PHD诱导HIF-1α表达来减少破骨细胞生成，实际上是通过增强成熟破骨细胞的骨吸收来实现的，HIF-1α可能主要调节破骨细胞介导的骨吸收，对破骨细胞分化几乎没有影响。

2.2.3HIF-1α调节间充质干细胞作用：间充质干细胞(MSCs)是属于中胚层的一类多能干细胞，主要存在于结缔组织和器官间质中，以骨髓组织中含量最为丰富，具有强大的增殖能力和多向分化潜能，在适宜的体内或体外环境下具有分化为肌细胞、肝细胞、成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、基质细胞等多种细胞的能力。

HIF-1α可通过调节miRNA-675-5P、VEGF、SDF-1的表达，直接或间接调控间充质干细胞的增殖、迁移以及向成骨分化作用，继续深入研究HIF-1α对间充质干细胞调节作用对骨质疏松症的防治有着不可忽略的价值。

Costa等[20]发现HIF-1α可通过miRNA-675-5P调节人间充质干细胞向血管成骨的作用，在低氧条件下HIF-1α的堆积会调低miRNA-675-5p的表达，进一步促进血管生成及MSCs的增殖。Yu等[33]研究了CoCl2诱导的细胞缺氧对MSCs成骨分化的影响，低氧增强了MSCs中HIF-1α的表达和STAT3的磷酸化，促进了成骨分化和VEGF表达，证明HIF-1α可通过STAT3信号促进间充质干细胞成骨分化和骨缺损愈合。Xu等[34]研究证明缺氧条件下HIF-1α的表达增加了MSC的趋化性迁移，在缺氧(1 %氧气)条件下培养4～6 h后，迁移的MSCs数量明显增加，同时，缺氧也增加了HIF-1α和基质细胞衍生因子(SDF-1)的表达, SDF-1及其受体CXCR4能够调节细胞迁移；敲低MSCs中HIF-1α的表达，不仅消除了MSCs的迁移，而且也减少了SDF-1的表达。Lee等[35]发现HIF-1α促进78 kDa葡萄糖调节蛋白(GRP78)的表达，通过HIF-1α-GRP78-Akt信号通路促进了MSCs的增殖和迁移潜能。

3 HIF-1α在治疗骨质疏松症中的应用

目前HIF-1α在治疗骨质疏松症方面的应用多停留在细胞和动物模型实验上，无论是单体还是中药复方，均可通过作用于HIF-1α来对骨质疏松症产生很好的治疗效果。红景天苷(SAL)是玫瑰红景天的主要活性成分，具有多种药理作用，Li等[36]在研究中发现SAL在体外和体内均显示出抗缺氧作用，在低氧环境中，SAL通过刺激细胞活力，分化和矿化作用以及上调Osterix和Runx2表达来增强成骨作用，而这些作用归因于HIF-1α信号通路的激活，SAL通过HIF-1α信号通路来保护MG63和ROB细胞免受CoCl2诱导的成骨细胞损伤和功能障碍。此外，研究还显示SAL改善了OVX引起的骨质疏松症，在OVX大鼠模型中，由VEGF表达增加引起的血管新生显著修复了OVX大鼠的骨骼，防止骨质流失和骨小梁微结构改变。Guo等[37]发现，SAL可通过MAPK / ERK和PI3K / Akt信号通路影响HIF-1αmRNA表达，SAL可增强HIF-1α靶基因转录活性来上调VEGF，并通过促进成骨细胞的增殖，分化，矿化来增强成骨作用，SAL也增加了血管生成和加速小鼠模型的骨折愈合。Yuan等[38]研究表明补肾通络汤(BSTLD)在OVX大鼠动物模型中，稳定了HIF-1α活性，随后增加了VEGF表达，并增强了血管生成和调节RANKL / OPG信号传导，保护卵巢切除引起的骨质疏松大鼠的小梁骨密度和小梁骨微结构。

4 展望

现阶段对骨质疏松症的认识已趋于成熟，其治疗方法也不断推陈出新，但是我们用于防治骨质疏松症的方法还远远不够。氧是骨细胞生长、发育及功能代谢的重要条件，氧感应细胞包括成骨细胞和破骨细胞的增殖分化以及骨血管在骨质疏松的形成、发展及防治中发挥着重要的作用。随着细胞感知和适应氧气的机制被揭开，HIF-1α可能成为骨质疏松症极具潜力的新靶点。但是目前HIF-1α对骨血管生成、骨代谢的作用仍缺乏深入研究，明确其作用机制，尤其是对破骨细胞作用机制成为目前亟待解决的问题。