激素性骨质疏松症发病机制的研究进展

余佩沅 任辉 沈耿杨 张志达 余翔 黄锦菁 招文华 尚奇 梁德 杨志东 江晓兵*

1．广州中医药大学，广东 广州 5104052．广州中医药大学第一附属医院，广东 广州 510405

糖皮质激素(glucocorticoid，GC)在临床疾病的广泛应用，据统计，1%的美国人长期使用GC进行治疗，然而长期使用GC具有明显的副作用，超过10%长期使用GC的患者被诊断为骨折，而且伴有明显的骨量流失，导致激素性骨质疏松症(glucocorticoid-induced osteoporosis，GIOP)的发病率逐年上升，在骨质疏松症中其发病率居于第三位，仅次于绝经后骨质疏松及老年性骨质疏松[1]。GIOP是一种由GC所引起的以骨量减少，骨的微细结构破坏，骨的脆性增加为特征，从而容易发生骨折的全身性骨病[2]。本文就GIOP的发病信号通路研究进行综述，以寻求更好的靶向治疗途径。

1 GIOP经典的发病信号通路

GC介导的骨质疏松症的形成途径主要通过抑制骨形成信号通路调控蛋白或促进骨吸收信号通路调控蛋白的合成或释放，最终造成骨量的流失。

GC 抑制 Wnt 信号通路，从而抑制骨形成。Wnt 信号通路与一些蛋白质的相互作用密切相关，对各种细胞和组织的发育和功能具有重要作用[3,4]。越来越多的证据[5,6]表明：Wnt/β-catenin信号通路也是控制成骨细胞(osteoblast，OB)代谢方面的重要分子机制之一，是成骨形成的必要条件。然而研究证明，GC 通过上调Wnt 抑制因子 DKK-1 和 sclerostin 的表达，激活GSK-3β和使 β-catenin 失去稳定性，衰减 Wnt 信号通路，下调OB Wnt 信号通路，从而抑制 Wnt/ β-catenin 经典途径。

RANKL由OB分泌，其结合并激活位于破骨细胞(osteoclast，OC)前体表面的受体RANK，诱导破骨的形成。OPG 则是 RANKL的天然抑制剂，能够抑制 RANKL 与OC上受体RANK 结合[7,8]。研究表明，GC不仅能促进OC生成和抑制 OPG 产生，并且刺激OB谱系产生OPG受体，与 RANKL 竞争OPG，从而促进骨的吸收导致骨量减少，骨强度降低。另有研究[9-11]结果表明hRANKL 敲除老鼠，通过抑制RANKL系统能防止激素性骨量减少和强度下降。

BMPs是诱导非成骨细胞分化为成熟成软骨细胞、OB的关键蛋白，对促进新生骨和软骨形成有重要[12,13]。GC可以拮抗BMP-2促进OB分化成熟、诱导软骨和新生骨形成的过程[14]。另有研究[15]发现GC可以通过影响BMP下游>50 kb的编码序列而抑制BMP的转录，且对BMP-2和BMP-4的抑制作用更为明显。

GC作用于骨代谢分子信号通路已经有一定的研究，除了上述所报道的分子信号通路以外，对于GIOP经典研究还包括PTH、Hippo、NF-κB、IGF-1通路等，在此不再作详细描述。

2 GIOP通路机制的研究进展

近年来，自噬相关信号通路已被证实在OB分化或OC退变过程中起到重要作用，而非编码RNA作为通路的调节因子和新型标志物，可作为GIOP发病机制研究另一新方向。

2.1 自噬

自噬是指一个吞噬或降解自身细胞质蛋白或细胞器，以实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新的过程[16]。人体随着年龄增长，体内自噬水平不断下降，这是年龄增长造成骨强度下降的一个原因[17]。mTOR在上游影响自噬诱导阶段负性调控自噬水平，而自噬通过参与调节OC的活性而调节骨吸收，mTOR 通路的抑制会促进自噬，同时mTOR的抑制可以降低OC的活性，减少OC数量mTOR是负性调控自噬水平的主要信号通路，自噬通过参与调节OC的活性而调节骨吸收，同时通过抑制mTOR以调节OB分化促进骨形成。而LC3、Beclin1蛋白是典型的自噬体的标志物[18]。

高水平的GC对OC的自噬有促进作用，GC诱导后OC的LC3-I和LC3-II的表达增加，同时对负向调控自噬水平的AKT、p70S6K mRNA的表达有明显抑制作用[19]。 研究GC对OB自噬水平的影响发现，低水平的GC对OB的自噬有一定促进作用，高水平的GC对OB的自噬是有抑制作用[20]。

通过上述可见GC对OB的自噬作用与浓度相关，生理剂量的GC作用于OB与OC，相互之间拮抗，保持骨量的平衡。如GC超过生理剂量，骨代谢则会失衡，OC自噬水平的增加，OB自噬减少是引起骨强度下降的一个重要原因。

也有研究[21]发现，GC能够影响BMSCs的增殖分化，而BMSCs体内自噬的作用有助于BMSCs增殖和防止凋亡，是应对GC造成骨量流失的重要途径。目前针对自噬与GIOP之间关系的研究已经取得了一定的进展。其具体通路机制复杂，还未能完全阐明，但是研究显示，自噬的作用影响了GIOP的发病、治疗的各个阶段，若加以研究，自噬途径将在预防和治疗GIOP领域发挥巨大作用。

2.2 非编码RNA

非编码RNA家族作为一种新型的通路调控因子，参与调节细胞的增殖、分化及代谢等生理过程，也参与调节机体的各种病理过程，对骨代谢过程有着重要影响作用。

2.2.1miRNA

miRNA是长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子，广泛存在于真核生物中，每个miRNA可以有多个靶基因，而若干个miRNA也可以调节同一个基因，通过这样的复杂调节网络而影响细胞增殖、分化及凋亡。Runx2 和其下游Osterix是miRNA的作用靶点，miRNA通过与其相互作用而调节骨代谢[22]。Runx2是促进OB分化和骨质形成的重要因子，其可促进骨钙素、碱性磷酸酶(ALP)等促成骨因子表达。Osterix(OSX)是继Runx2后发现的促进OB分化的另一重要因子。且miRNA水平能反应BMSCs 分化作用，部分miRNA在BMSCs向OB分化过程中表达减少[23]。

有研究[24]发现在GIOP动物模型中的miRNA表达发生了显著变化，以 miR-672-5p的上调和miR-146 a-5p的下调最为明显，这表明它们有可能参与骨代谢的调节。在体外实验方面，miR-106b在体外能负向调控BMSCs的分化，抑制OB成熟分化，且在GIOP模型小鼠中表达增加[25]。GC可诱导OC分化且抑制了miR-338-3p的表达，增加骨吸收，且这可能与RANKL通路有所关联[26]。而Liang等[27]发现，miR-124可以减少GC受体的表达，从而阻止了GC对骨形成的抑制作用。另外，GC也能下调miR34 a表达[28]，而miR34 a能通过靶基因对骨代谢、干细胞增殖与分化、OB、OC的增殖与分化、细胞周期及细胞凋亡与自噬等均具有重要调控作[29]。这些基础实验研究表明，miRNA作为一种重要的通路调控因子，无论从成骨还是破骨通路，miRNA都能从中影响骨代谢，而且在GC的调控下，不少的miRNA都有不同的上调或下调，而通过对这些特异性 miRNA 的不断发现和深入研究，为今后开展更多miRNA相关临床实验打下坚实的基础。

而在临床方面，已有学者发现在激素性股骨头坏死的患者血浆中，miR-1207-5p和miR-887的表达明显上调，明显下调的是miR-96-5p和miR-576-5p，这说明miRNA在GC影响骨代谢当中起了一定作用，那么在GIOP患者血清中这些miRNA是否也存在上调或下调呢？这也是值得我们以后思考和研究的。

miRNA的种类繁多，且调控网络复杂，但miRNA特异性较高，可作为新的生物学标记，若加以研究，深入认识其生物学效应，更好地帮助研究GIOP的发病机制，并可能提出新的诊断依据，为该病的靶向治疗提供一个全新的技术平台。由于现阶段我们对miRNA 的认识和研究还十分有限，对于数目庞大未知的特异性miRNA，我们需要努力去探索；对于已知的特异性miRNA还要继续深入研究，明确其功能、调控机制、作用靶点、作用剂量、活性因素、表达时序性及不同miRNA在同一生命过程中相互之间的联系对靶向治疗GIOP必有重大帮助。

2.2.2lncRNA

长链非编码RNA(long non-coding RNA, lncRNA)是指长度大于200个核苷酸的非编码RNA，lncRNA不止在遗传信息中承担载体的角色，而且更多地承担了对细胞周期、分化的调控功能，从而对骨代谢形成重要作用。

Tong等[30]发现骨质疏松患者中的lncRNA-DANCR表达呈现高表达，同时DANCR对TNFα、IL-6等影响OC的炎症因子的表达有促进作用。Li等[31]在骨质疏松大鼠模型发现lncRNA-H19可以通过抑制Wnt信号通路，进一步促进Dkk-4的表达，从而抑制骨形成。

虽然lncRNA已被证实在动物模型的骨代谢过程中有一定的调控作用，但对lncRNA的研究仍处于起步阶段，仍需大量的基础及临床相关实验去证实lncRNA对骨代谢影响的作用，且目前对lncRNA与GIOP的靶向研究仍较缺乏，GC对lncRNA影响的需要进一步研究。

3 通路间的交联反应(crosstalk)

各信号通路和调节因子已被证实对GIOP的形成有着重要作用，而随着信号通路研究的不断深入，发现各通路或调节因子之间有相互联系的，因为细胞不是一个独立的个体，每个细胞之间都可以通过发送信号进行细胞间的交流，而且细胞间可以通过几个不同信号系统进行相互联系，细胞间通过这种“串话”可以调节细胞的生物反应，从而影响机体发育和调节体内平衡。

3.1 Wnt与其他通路的交联

上文提到Wnt信号在影响骨形成方面有重要作用，而研究发现，Wnt/β-catenin与OPG/RANKL/RANK两通路在影响骨代谢作用中是有相互“串话”， GC可以通过抑制Wnt信号通路的β-catenin来下调OPG的表达，从而诱导RANKL的生成，而Dkk-1作为Wnt/β-catenin信号的负向调控因子，在GIOP模型中也可以通过抑制BMSCs向OB分化，进一步减少OPG的表达，上调RANKL/OPG的比例，促进骨吸收[32]。

另外，Wnt/β-catenin与BMP拮抗GIOP骨量流失过程中通路间也是有相互联系的，Wnt可以促进BMSCs不断分化，成为成骨前体细胞，由于Wnt信号的作用，可以不断维持细胞的前体状态，而BMP却有促进成骨前体细胞分化为成熟的OB，虽然它们对成骨前体细胞有着相反的作用，但是一旦成骨前体细胞分化成为成熟的OB，Wnt与BMP之间发生协同作用，促进OB进一步成熟分化，分泌ALP，加强骨形成。可见Wnt与BMP之间在骨形成的不同阶段分别发生拮抗或者协同作用[33]。

Hippo信号通路也是影响骨代谢的一个重要通路，TAZ (transcriptional co-activator with PDZ-binding motif) 是 Hippo信号下游的一个激活因子。研究发现，GC可以促进TAZ的表达，且TAZ对Wnt/β-catenin通路有抑制作用，通过促进β-catenin的磷酸化降解，抑制catenin转位入核与启动靶基因的结合，从而抑制了骨形成[34]。

虽然Wnt/β-catenin作为经典的骨代谢通路，已经有大量的基础和临床相关的研究，但Wnt/β-catenin通路靶向因子多，与其他通路关键因子的crosstalk调控网络复杂，在未来仍有一定的研究潜力。

3.2 自噬与其他通路的交联

高燕等[35]探讨了自噬与BMPs间的关系，发现BMP-2能有效促进细胞株C2C12、MC3T3-E成骨分化，成骨分化指标ALP、SP7等增高，与此同时，自噬标志物LC3-Ⅱ和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ反映的自噬水平也随着成骨分化而先增强后减弱。而3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine，3-MA)是一种不依赖mTOR通路的自噬抑制剂，当其作用在C2C12、MC3T3-E细胞时，随着水平增高，细胞成骨分化明显受抑制，ALP的表达降低，而这很可能是BMP-2受体被阻断所造成的。

另有学者也研究了自噬与OPG/RANKL/RANK通路之间的相关联系，利用RANKL诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7分化为成熟OC，而在此过程中自噬相关标志物LC3-Ⅱ表达增多，这表明自噬参与了RANKL所诱导的破骨分化过程[36]。

可见自噬在成骨和破骨的通路调控中都有一定作用，但由于3-MA可能存在着非特异性，若能对其自噬相关基因进行敲除研究，可以提供更明确的证据。

3.3 miRNA与其他通路的交联

miRNA作为一种新型的调控因子，也参与和其他信号通路的“串话”，研究[37]发现，GC促进miR-214的表达，且利用BMP-2诱导BMSCs成骨分化的过程中，miR-214作为OSX通路的抑制剂参与了调节，抑制了OB形成。miR-29 a通过Wnt信号通路促进OB分化，加强骨细胞形成，能有效拮抗GC所造成的骨量流失[38]。细胞成骨分化过程中，发现miR-27通过激活与骨形成关系密切的Wnt信号通路促进hFOB1.19的成骨分化。证实了腺瘤性结肠息肉病蛋白(APC) 为miR-27的靶基因。APC通过作用其靶点β-catenin，涉及对 Wnt 信号通路的调控。miR-27通过抑制APC表达，促进β-catenin的高表达，从而正向调控了成骨分化[39]。

miRNA和自噬对细胞的调控对维持人体骨量平衡有重要作用，miRNA能够调节包括自噬在内的许多细胞进程，而细胞的自噬在维持miRNA内环境稳定发挥一定作用，两者之间有一定的联系[40]。You等[41]研究发现，miR-378的过度表达可以抑制成骨分化，而这很可能是通过自噬相关通路PI3K-Akt所完成的。而Sun等[42]也发现miR-20 a能作用于巨噬细胞时，能明显下调LC3、Beclin1等自噬相关标志物的表达，可见两通路间的交联对调控骨代谢有一定作用，但两者之间的“串话”对GIOP的形成机制仍不明确。

4 小结

寻找GIOP相关分子信号通路上的作用靶点并进行相关的靶向治疗，是有效防治GIOP的重要途径。目前对GIOP的发病相关分子信号通路的研究不断深入，从最开始的Wnt/β-catenin、OPG/RANKL/RANK等经典信号，到近年来对自噬、非编码RNA和crosstalk的研究。各个通路间相互联系，相互作用，共同构成了调控GIOP发病的信号网络。然而，我们目前的研究层面很可能只是这个复杂的调控网络中的冰山一角，许多通路和调节因子的研究仍处于起步阶段，大部分通路研究也仅局限于单一信号通路，虽然现有研究证实部分通路间的crosstalk能够调控GIOP的发生，但具体机制很多仍未阐明。

但是，由于信号通路的作用位点明确，而针对信号通路的靶向治疗效果也更精确。因为通路间并非是完全独立的，这使得未来GIOP的治疗变得更加复杂。为获得更为有效、安全的GIOP靶向治疗药物，针对目前的研究现状，仍需要更多的基础及临床实验研究，探究各种新型靶向药物之间的相互作用，为临床实践提供更多可靠的偱证医学证据。