基于人类全基因表达谱技术对“肾精亏虚证”原发性骨质疏松患者差异基因表达分析

辛华 谢晚晴 蒋宁 孙丽 郑洪新

辽宁中医药大学，辽宁 沈阳 110032

原发性骨质疏松症(Osteoporosis，简称OP)，是指低骨量和骨组织微细结构破坏，以骨的脆性增加和易发骨折为主要特征的全身性、代谢性骨骼疾病[1]。OP主要包括绝经后骨质疏松症、老年性或退行性骨质疏松症，主要临床表现为全身骨痛，其中腰背部疼痛是最常见症状，以及身长缩短、驼背、骨折等，有时可无明显症状。随着我国人均寿命的延长和人口老龄化的加重，其发病率呈明显上升趋势，已成为老年人的常见病和多发病[2]。现代病因学认为，OP与激素调控、营养状态、物理因素、免疫状况及遗传等因素有关。

中医学典籍中无“骨质疏松”这一病名，根据病因病机和临床表现可将其归于“骨枯”“骨极”“骨痿”“骨痹”和“骨蚀”等范畴，其中定性定位较准确的当属“骨痿”[3]。中医学认为，肾藏精，主骨生髓，肾精充足，则骨髓的生化有源，骨骼才能得到骨髓的充分滋养而坚固有力；若肾精亏虚，骨髓化源不足，不能濡养骨骼，便会出现骨骼脆弱乏力，引发骨质疏松。OP病位虽在骨，但与肾密切相关。肾为先天之本，藏先后天之精气，寓元阴元阳。人之生长壮老取决于肾中精气之盛衰变化，而骨骼功能正常亦有赖于肾精充盈、骨髓生化有源，因此，随年龄增长人体步入衰老阶段，肾精不足，OP发病率显著增高。可见，肾精亏虚，髓少骨枯骨痿是本病的基本病机。国内已有大量临床研究表明，通过补肾法为主治疗OP获得明显疗效。

本研究采用人类全基因组表达谱芯片检测肾精亏虚证OP患者基因表达谱，对比OP患者和同龄健康人组，筛查与OP相关的差异表达基因，探讨“肾精亏虚”衰老病机的OP患者相关基因的信息学特征，进一步为临床“从肾论治”OP提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 研究对象

原发性骨质疏松组(OP group)：从辽宁中医药大学附属医院和上海中医药大学附属龙华医院门诊肾精亏虚证原发性骨质疏松症患者群中随机选择16例患者，男女各半，年龄60岁以上。

纳入标准：①符合OP的诊断标准：参照中华医学会骨质疏松和骨矿盐疾病《原发性骨质疏松症诊治指南2011》。②符合肾精亏虚证诊断标准：参照国家标准《中医临床诊疗术语》肾系证类肾精(气)亏虚证的诊断标准。③年龄在60-75岁之间。④签署知情同意书者。

排除标准：①不符合纳入标准者。②同时患有其他疾病或合并症，以及其它证候。③某些特征人群，如精神病患者、病情危笃或疾病的晚期患者。④患有心、肝、肾损害等器质性疾病。

对照组(control group)：辽宁中医药大学附属医院体检中心随机选择健康状态(躯体、心理及社会生活无异常，不吸烟，不饮酒，无饮食偏嗜)老年人24例，男女各半，年龄60岁以上。

1.2 实验材料

PrimeViewTMHuman Gene Expression Array，Affymetrix公司生产；cRNA扩增标记试剂盒，Ambion生产，LOT NO：#1792；First Stand cDNA Synthesis Kit，BioLabs公司生产，LOT NO：E6560S；SYBR Green PCR Kit，QIAGEN生产，LOT NO：204143。

1.3 样本采集

收集符合上述标准的OP组和对照组人群，清晨经肘前静脉采集5 mL血液，加入血液总RNA快速提取试剂(百泰克生产)，混合均匀，-70 ℃保存。干冰冷冻，统一寄送北京博奥生物有限公司。

1.4 指标检测

1.4.1基因芯片检测及生物信息学分析：利用Affymetrix公司的PrimeViewTMHuman Gene Expression Array基因表达谱芯片，分析两组基因差异表达。提取总RNA，并对总RNA进行定量、质检。以总RNA为起始，进行体外扩增和生物素标记，然后用于芯片杂交；使用AGCC软件进行芯片清洗和染色，然后扫描芯片；使用AGCC软件对芯片图像进行分析，把图像信号转化为数字信号，然后对数据进行校正和归一化处理(数据预处理采用RMA算法[4]进行)。对预处理后的数据进行基因差异表达分析：利用SAM(significance analysis of microarray)R程序包[5]分析差异基因，差异基因的筛选标准是：q-value≤5%，且Fold Change≥1.5或≤0.5。对筛选到的差异表达基因进一步进行Gene Ontology(GO)功能富集分析和Pathway分析。

1.4.2差异基因表达的验证：Realtime-PCR 检测差异表达基因mRNA 表达：利用Primer Premier 5.0 软件设计PCR引物，引物由上海生工公司合成。

从OP组及对照组分别随机选取 10 例血液，提取总 RNA，进行RT-PCR检测。逆转录按照BioLabs公司First Stand cDNA Synthesis Kit(E6560S)说明书操作，荧光定量按照 QIAGEN 的 SYBR Green PCR Kit(204143)说明书操作。PCR 反应所用引物序列见表1，以 GAPDH 作为内参。

表1 实时荧光定量PCR引物序列Table 1 Primer sequences for quantitative real-time PCR

2 结果

2.1 肾精亏虚证OP患者差异表达基因筛选

表2 上调差异基因表达倍数超过3倍的基因Table 2 Expression of up-regulated differential genes by 3 times

表3 下调差异基因表达倍数小于0.5倍的基因Table 3 Expression of down-regulated differential genes by 0.5 times

与同龄健康状态老年人对照组比较，肾精亏虚证OP患者中特异性表达的探针有910个，对应602个基因(FC≥1.5或FC≤0.667，q-value≤5%)，其中上调基因579个，下调基因23个(见图1)，图中红点表示该基因在OP组中的表达明显高于对照组(上调)，绿点反映该基因在OP组的表达明显低于对照组(下调)。上调倍数超过3倍的基因有7个，分别为S100P、SNX3、DEFA1、MMP9、LTF、ANXA3、IL1R2、PLSCR1(见表2)；下调倍数高于2倍的基因有3个，分别为CX3CR1、SPON2、GNLY(见表3)。

2.1.1肾精亏虚证OP患者差异表达基因(GO)功能注释分析：对肾精亏虚证OP患者差异表达基因进行Gene Ontology(GO)功能注释，GO分析可从生物学过程(BP)、细胞组分(CC)、分子功能(MF)三个方面对差异表达基因涉及的功能进行注释、富集、聚类。

图1 OP患者差异表达基因的散点图Fig.1 The scatter chart of differential expressed genes

用DAVID对差异蛋白进行GO富集分析显示，涉及GO-BP功能的主要参与免疫应答(10.6%)、防御应答(10%)、编程性细胞死亡调控(9%)、受伤应答(7.8%)、编程性细胞死亡(7.5%)、膜组织(5.3%)、炎症应答(5.3%)、细菌应答(4.7%)、脂多糖应答(2.5%)、细菌来源的分子应答(2.5%)等过程；差异基因涉及GO-MF功能的以结合功能为主，酶结合(6%)、二聚体蛋白的活动(5.5%)、GTP结合(4%)、鸟嘌呤核苷酸结合(4%)、GTP酶活性(3.5%)、小结合蛋白连接酶活性(2.3%)、核酸结合(1.7%)、细胞因子受体活性(1.3%)。

2.1.2肾精亏虚证OP患者差异表达基因Pathway分析：KEGG Pathway分析显示，这些差异表达基因主要属于趋化因子信号转导通路(3.8%)、系统性红斑狼疮(2.8%)、白细胞跨内皮迁移(2.7%)、造血细胞系(2.3%)、FcγR-介导吞噬(2.2%)、病毒性心肌炎(1.8%)、幽门螺杆菌感染的上皮细胞信号(1.5%)、同种异体移植排斥(1.2%)、移植物抗宿主疾病(1.2%)、1型糖尿病(1.2%)等。

2.2 肾精亏虚证OP患者差异表达基因的PCR验证结果

针对上述差异基因表达进行荧光定量PCR扩增验证，验证结果与基因芯片检测结果一致。与同龄健康状态老年人比较，肾精亏虚证OP患者S100P、SNX3、DEFA1、MMP9、ANXA3、IL1R2、PLSCR1基因的mRNA表达显著增加，具有统计学意义(P<0.05)，详见图2。与同龄健康状态老年人比较，肾精亏虚证OP患者CX3CR1、SPON2、GNLY基因的mRNA表达明显下调，具有统计学意义(P<0.05)，详见图3。

图2 肾精亏虚证OP组上调显著的差异基因表达Fig.2 The expression of significant up-regulated genes in OP-KED group

图3 肾精亏虚证OP组下调显著的差异基因表达Fig.3 The expression of significant down-regulated genes in OP-KED group

3 讨论

肾主骨、生髓的生理功能，实际上是肾之精气具有促进机体生长发育功能的一个重要组成部分。中医学认为，肾藏精，精生髓，髓藏于骨腔之中，髓养骨，促进骨骼生长发育。如《素问·阴阳应象大论》：“肾生骨髓”；《素问·平人气象论》：“肾藏骨髓之气”[6]。髓藏与骨腔之中，以充养骨骼，所谓“肾充则髓实，髓实则骨壮”，故称“肾主骨”，见于《素问·宣明五气》。《素问·六节藏象论》又称：“肾者……其充在骨。”因此，肾-精-髓-骨组成一个系统，有其内在联系。肾精充足，髓化生有源，骨质得养，则发育旺盛，骨质致密，坚固有力。

反之，如肾精亏虚，骨髓化生无源，骨骼失其滋养。在小儿，就会骨骼发育不良或生长迟缓，骨软无力，囟门迟闭等；在成人，则可见腰膝酸软，步履蹒跚，甚则脚痿不能行动；在老年，则骨质脆弱，易于骨折等[7]。如《素问·逆调论》：“肾不生则髓不能满。”《素问·痿论》：“肾气热，则腰脊不举，骨枯而髓减，发为骨痿。”

中医药防治原发性骨质疏松症具有较好的疗效，尤其在改善临床症状方面。据文献报道，目前多数研究者认为骨质疏松症的根本原因为肾精亏虚，中医药治疗多以补肾为主[8-12]。但是，其疗效机制尚不清楚，发病机制也需要更加深入的研究。

本研究采用高通量基因芯片技术研究人类全基因组表达谱，探讨原发性骨质疏松患者和同龄健康状态老年人的差异基因表达。初步结果显示：两组人群血清中特异性表达的探针有910个，对应602个基因(FC≥1.5，q-value≤5%)，其中上调基因579个，下调基因23个。上调倍数超过3倍的基因有7个，分别为S100P、SNX3、DEFA1、MMP9、ANXA3、IL1R2、PLSCR1；下调倍数小于0.5倍的基因有3个，分别为CX3CR1、SPON2、GNLY。对差异基因表达进行荧光定量PCR扩增验证，结果与基因芯片检测结果一致。

用DAVID对差异蛋白进行GO富集分析以及 KEGG Pathway等进行生物信息学分析显示，差异基因表达主要涉及参与免疫、防御、受伤、炎症、细菌、脂多糖等应答，编程性细胞死亡及其调控等生物学过程；并与酶、GTP、鸟嘌呤核苷酸、GTP酶、核酸结合，二聚体蛋白的活动，小结合蛋白连接酶活性，细胞因子受体活性等分子功能，以及趋化因子信号转导通路等有关。

其中，与原发性骨质疏松症发病机制比较重要的差异基因表达：S100蛋白(S100P)家族，是多功能信号蛋白，通过转导钙依赖性的细胞调节信号，在酶的活化、蛋白磷酸化、细胞周期调控、基因表达转录、细胞增殖分化、黏附运动、细胞凋亡及维持细胞内外Ca+平衡等多种生物学过程中发挥重要作用[13,14]。研究表明，S100蛋白与成骨细胞分化及成骨性骨肉瘤侵袭转移等方面有着密切关系[15]。可能参与调节骨形成或骨吸收[16]。袁赤亭的研究结果表明，S100蛋白在去势大鼠股骨头中的表达规律为术后2个月之内处于高表达状态；术后3个月与假手术组比较无统计学差异；术后4-6月呈低表达[17]。由此可见，S100在骨质疏松过程中发挥着重要的骨代谢调控作用。

分选连接蛋白3(sorting nexin 3，SNX3)是分选连接蛋白家族(sorting nexins)的重要成员之一，有多种生物学功能，其中最重要的是参与胞内多种蛋白分子的转运、内体的成熟与分选等[18]。

防御素(defensin，DEFA1)最早被认为是一种杀菌肽，经进一步的研究发现，它不仅具有抗菌作用，而且还能抗真菌和病毒等多种微生物感染的作用，在机体非特异性以及获得性免疫应答中发挥重要的作用[19]。

基质金属蛋白酶9(MMP-9)是人体内最重要的蛋白酶之一，属于基质金属蛋白酶超家族成员中明胶酶的一种，又称明胶酶B，其主要功能是分解细胞外基质，参与人体许多生理及病理过程。该因子在人体内很多细胞中，包括在破骨细胞中都能表达，其表达又受到体内众多因子的调节，如细胞生长因子、基质金属蛋白酶组织抑制剂(TIMPs)等，其作用底物主要是Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ型胶原，明胶及弹性纤维[20]。研究表明，骨桥蛋白(OPN)激活NF-κB信号通路，上调MMP9蛋白及基因表达，调控成骨细胞破骨及细胞的增殖和分化能力[21-24]。

膜联蛋白(annexin，ANX)在细胞内的表达量较高，约占细胞总蛋白的1%-2%，是依赖钙离子调控的酸性膜磷脂结合蛋白超家族。其家族包括A、B、C、D 和 E五类。据文献报道，ANX家族蛋白参与了包括细胞增殖、信号转导、胞吞与胞吐、分化与凋亡、炎性反应调控及抗凝血反应等一系列重要的细胞生理过程[25]。ANXA3是膜联蛋白超家族的一员。

白细胞介素1受体2(IL1R2)作为诱饵受体，主要表达于嗜中性粒细胞、B细胞、单核细胞和巨噬细胞[26]。IL1R2是可以螯合IL-1β的诱饵分子，并阻断下游信号传导的起始，从而防止炎症。IL1R2受体可使一些复杂疾病中的炎症减轻，如强直性脊柱炎、关节炎等[27,28]。

磷脂爬行酶1(PLSCR1)是Ca2+结合的棕榈酰化Ⅱ型膜蛋白，棕榈酰化后定位于细胞膜，参与细胞的增殖、分化和凋亡，同时PLSCR1还是多种激酶的底物[29]。

C-X3-C趋化因子受体1(CX3CR1)是fractalkine的唯一受体，二者的相互作用,可通过提高细胞黏附和促进CX3CR1 阳性细胞的跨膜转移在组织损伤中发挥作用[30]。

脊椎蛋白2(SPON2)是脊椎蛋白(spondin)家族成员之一。研究表明，骨骼发育受Wnt/β-catenin信号通路的调控[31]，Wnt/β-catenin信号通路通过促进成骨细胞的发育、分化和激活OPG基因表达而调控骨骼的发育[32]。另有研究表明，spondin可激活并协同Wnt/β-catenin信号通路参与对细胞增殖和分化的调控[33]。

颗粒溶素(granulysin，GNLY)是脂蛋白皂素样蛋白家族的一员，与穿孔素和颗粒酶共同定位与人细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和自然杀伤细胞(NK)的溶细胞颗粒上[34]。颗粒溶素具有溶细胞和杀菌的活性，其作用对象包括肿瘤细胞、细菌、真菌和寄生虫。随着人们对颗粒溶素研究的深入，颗粒溶素的抗菌、抗肿瘤作用也越来越多的被人们所了解，其在超级细菌感染中起到重要免疫作用[35]。

综上所述，肾精亏虚证OP患者的差异基因表达上调或下调显著，提示免疫应答、防御应答、趋化因子信号转导通路在骨质疏松发病过程中可能发挥着重要的作用。结合以往文献报道，S100P家族的调控信号转导作用；SNX3的参与胞内多种蛋白分子的转运作用； DEFA1、CX3CR1及SPON2的调控免疫应答作用；ANXA3、IL1R2、CX3CR1、GNLY介导的炎症反应作用；SPON2激活并协同Wnt/β-catenin信号通路促进成骨细胞的发育、分化作用；MMP/TIMP动态平衡破坏等，均有可能在骨质疏松发病过程中发挥重要的作用。

本研究初步结果为后续关于骨质疏松症的发病机制相关研究开拓思路，为肾精亏虚证骨质疏松症中医药防治提供可能的作用靶点。根据本次差异基因筛查结果，后续我们将开展靶基因预测、针对靶基因信号调控机制进行深入研究。