槲皮素对小鼠胶原诱导性关节炎症的影响

贾庆运 王拥军 梁倩倩 施杞*

1. 上海中医药大学附属龙华医院，上海 200032 2. 上海中医药大学脊柱病研究所，上海 200032 3. 上海中医药大学康复医学院，上海 200120 4. 筋骨理论与治法教育部重点实验室，上海 200120

胶原诱导性关节炎(collagen-induced arthritis, CIA)是最常用的类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis, RA)的动物模型，其在临床症状和病理表现方面与类风湿性关节炎极为相似或相同(诸如关节滑膜增生、关节翳形成和软骨破坏等)，因此, CIA是研究RA较为理想和常用的动物模型[1, 2]。槲皮素(Quercetin)是一种广泛存在于自然界的的黄酮类化合物，具有抗炎、抗氧化、抗凋亡、清除氧自由基以及免疫调节等活性。临床研究表明，槲皮素对缓解膝关节骨性关节炎、类风湿性关节、运动后机体疼痛具有良好的作用[3-7]。本研究以胶原诱导性关节炎小鼠为RA模型，通过观察槲皮素对CIA小鼠的改善情况，进一步为临床应用本方提供新的实验的依据。

1 试验材料

1.1 实验动物

SPF级雄性DBA/1 J小鼠，40只，6-7周龄，购于北京北京维通利华实验动物技术有限公司，饲养于上海中医药大学实验动物中心。

1.2 试剂及药物

槲皮素(Quercetin)购成都普菲德生物技术有限公司纯度>98%(批号：JOT-10049)，牛属II型胶原(Bovine type Ⅱ collagen)(Chondrex Inc)，完全弗氏佐剂(complete Freund’s adjuvant) (Chondrex In)，不完全弗氏佐剂(incomplete Freund’s adjuvant) (Chondrex Inc), 甲氨蝶呤(上海东方药品科技实业有限公司)。

1.3 仪器

电子天平，游标卡尺，OLYMPUS BX50显微镜，制冰机等。

2 方法

2.1 药物制备

槲皮素200 mg溶于40 mL的5%CMC-Na制成混悬液，浓度50 mg/mL甲氨蝶呤3 mg溶解于30 mL生理盐水中，制成甲氨蝶呤溶液，浓度为0.1 mg/mL。查阅相关文献确定槲皮素素小鼠给药浓度为50 mg/kg·d灌胃，甲氨蝶呤给药浓度为0.5 mg/kg，每3天1次腹腔注射。

2.2 CIA小鼠模型的建立

6-7周龄40只的DBA/1 J小鼠适应性喂养1周，运用SPSS软件进行随机分为对照组、模型组、甲氨蝶呤组和槲皮素组，每组10只，除10只正常对照组外，其余30只小鼠进行CIA造模。将10 mg牛Ⅱ型胶原溶于0.01 mmol/L的醋酸溶液5 mL，4 ℃摇床过夜，取5 mL含2 mg/mL的完全弗氏佐剂等体积混合，20 mL注射器连接装置4 ℃来回抽吸2000次充分乳化，制得抗原乳剂，并置4 ℃ 冰箱保存备用。首次免疫于小鼠尾根部皮下注射Ⅱ型胶原乳剂0.1 mL，造模第21天取0.1 mLⅡ型胶原和不完全弗氏佐剂混合的乳剂进行加强免疫1次; 正常组同法注射等体积生理盐水。

2.3 动物分组给药

二次免疫后第1天开始给药，槲皮素组给予0.2 mL混悬液灌胃，甲氨蝶呤组给予 0.1 mL甲氨蝶呤溶液腹腔注射，每3天1次，正常对照组和模型组给予0.2 mL生理盐水灌胃，各组连续给药30天。

2.4 指标检测

体重：小鼠于造模第0、5、10、15、20、35、40、45、50天测体重。关节炎指数：小鼠给药后第0、5、10、15、20、25、30天给予关节炎症指数评分，评分标准[8, 9]0分：没有明显的关节红肿；1分:踝关节或趾关节轻度红肿；2分：从趾关节到踝关节轻度红肿；3分：从趾关节到踝关节中度红胀；4分：严重的踝关节到整个足掌的红肿，每只小鼠最高评分16分。足掌厚度：小鼠给药后第0、5、10、15、20、25、3天0给予选取肿胀的足掌给予测肿胀的厚度，用游标卡尺选取肿胀最甚处测量，单位为mm。受累足掌数：小鼠给药后第0、5、10、15、20、25、30天给予记录小鼠受累足掌数，每只小鼠最高评分4分。病理学评分： 给药第30天后给予小鼠处死，取小鼠踝关节多聚甲醛固定，24 h后给予EDTA脱钙、石蜡包埋、切片、HE病理学染色。显微镜下观察各组小鼠关节滑膜增生、炎性细胞浸润、血管翳形成、软骨和骨侵蚀方面行病理学评分，按正常和轻、中、重度异常分别计 0～3 分，评分标准[10]0分：正常滑膜组织；1分: 滑膜增生，炎性细胞浸润；2分：血管翳形成，软骨侵蚀；3分：软骨破坏伴软骨下骨侵蚀。

2.5 统计学方法

统计结果采用均数±标准差进行描述，应用SPSS 17.0统计软件，进行单因素方差分析，以P<0.05认为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 槲皮素对CIA小鼠体重的影响

与正常对照组相比，各造模组小鼠体重均有不同程度的降低，治疗后各组体重均较模型组降低减少，各组间体重差异无统计学意义(P>0.05)。(图1)

3.2 槲皮素对CIA小鼠关节炎指数的影响

二次免疫后第2天开始，模型组小鼠开始炎症反应期，前后足踝关节开始红肿，关节炎指数明显增加，治疗30天后，与模型组相比槲皮素组和甲氨蝶呤组显著降低小鼠关节炎指数，差异有统计学意义(槲皮素组与模型组比较*P<0.05，甲氨蝶呤组与模型组比较#P<0.05)。(图2)

图1 槲皮素对CIA小鼠体重的影响Fig.1 Effect of quercetin on body weight in CIA mice

图2 槲皮素对CIA小鼠关节炎指数的影响Fig.2 Effect of quercetin on the arthritis index in CIA mice

图3 槲皮素CIA小鼠足掌肿胀厚度的影响Fig.3 Effect of quercetin on paw swelling of CIA mice

3.3 槲皮素对CIA小鼠足掌肿胀厚度的影响

造模20天后，与对照组相比各模型组小鼠出现不同程度足掌肿胀，治疗后30天后，与模型组相比槲皮素组和甲氨蝶呤组显著降低小鼠足掌的肿胀厚度，差异有统计学意义(槲皮素组与模型组比较*P<0.05，甲氨蝶呤组与模型组比较#P<0.05)。(图3)

3.4 槲皮素对CIA小鼠踝关节病理学形态及病理学评分的影响

治疗后30天后，小鼠踝关节常规取材、脱水、包埋、切片、HE染色，正常组小鼠的踝关节病理切片显示关节间隙正常清晰，软骨表面光滑，无明显的滑膜增生及炎症细胞的浸润，模型组小鼠踝关节显示大量炎症细胞的浸润和滑膜的增生、关节软骨和骨的破坏，与模型组相比槲皮素组和甲氨蝶呤组踝关节炎症细胞的浸润和滑膜增生、关节软骨和骨的破坏明显减轻，病理评分明显降低，与模型组相比差异有统计学意义(槲皮素组与模型组比较*P<0.05，甲氨蝶呤组与模型组比较#P<0.05)。(图4)

4 讨论

图4 槲皮素对CIA小鼠踝关节病理学形态及病理学评分的影响Fig.4 Effect of quercetin on pathological morphology and pathological score

槲皮素是人类饮食中最主要的生物类黄酮类化合物，广泛存在于植物的花、叶、果实中[11, 12]。槲皮素具有抗炎、抗氧化、免疫调节等作用[13-17]，相关研究表明槲皮素可有效减轻免疫细胞炎症因子的分泌的作用[18-21]，这种抑制作用可能和槲皮素因抑制核转录因子NF-κB的生物活性相关[22]。相关临床观察性研究表明，槲皮素对疼痛类疾病的缓解具有良好的作用，对于骨性关节炎、类风湿性关节炎的疼痛的缓解同样效果良好[4, 5, 23-30]。

胶原诱导性关节炎小鼠模型(CIA模型)是目前应用较广泛和成熟的动物实验模型，其在外在体征、发病机制、病理改变及实验室指标等方面与人类类风湿关节炎(RA)相似，是目前最适合用于研究人类RA的动物模型。本研究通过CIA小鼠模型模拟RA疾病的发生发展过程，观察槲皮素对于CIA小鼠模型的作用，结果显示槲皮素可有效的减轻CIA小鼠的关节炎症，减轻关节炎症指数、足掌的肿胀厚度，同时可有效的减轻CIA小鼠关节的病理表现，减轻关节滑膜的增生、炎性细胞浸润、血管翳形成、软骨和骨侵蚀。

综上所述，槲皮素可有效的减轻CIA小鼠的肿胀厚度，降低关节炎症指数，减轻关节的破坏从而发挥其抗炎作用，槲皮素是治疗类风湿性关节炎的潜在有效药物。