龟板调控BMSCs增殖、迁移和成骨分化及其抗骨质疏松症的研究进展

余翔 任辉* 沈耿杨 张鹏 余富勇 尚奇 汤凯 张志达 招文华 梁德 江晓兵,3*

1. 广州中医药大学第一附属医院脊柱骨科，广东 广州 510405 2. 广州中医药大学，广东 广州 510405 3. 广州中医药大学岭南医学研究中心，广东 广州 510405

骨质疏松症(osteoporosis，OP)是易导致骨折等严重并发症的一种全身性系统性骨代谢疾病，严重威胁患者生命健康，给家庭、社会带来了沉重负担[1-2]。如何有效防治OP是目前的难题。中医药在防治OP方面具有独特优势[3-4]。龟板有补肾强骨、填精益髓的功效，可通过调控骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖、迁移及成骨分化，促骨形成，改善OP骨损害，从而有效抗各种OP，如绝经后骨质疏松症(PMOP)、激素性骨质疏松症(GIOP)和老年性骨质疏松症(SOP)。龟板通过调控骨代谢相关microRNAs、细胞信号通路及相关因子表达调控BMSCs增殖、迁移和成骨分化，从而起到抗OP作用。本文将围绕当前文献报道的龟板对BMSCs增殖、迁移和成骨分化的调控机制及其抗OP作用机制的相关研究进行综述，旨在为中医药抗OP提供参考。

1 龟板对BMSCs增殖、迁移和成骨分化的调控作用及机制

1.1 龟板对BMSCs增殖的影响

据报道[5-7]，龟板含药血清可上调骨形态发生蛋白-4(BMP-4)表达促大鼠BMSCs增殖，该作用呈量效和时效依赖性。陈东风等[8]证实，乙酸乙酯萃取的龟板提取物(PTE)可呈剂量和时间依赖性促BMSCs增殖，低浓度(30 μg/mL)PTE干预BMSCs 1 d时无明显促增殖效果，干预3 d时显著促增殖；而高浓度(300 μg/mL)PTE干预1 d时可显著促增殖。此外，他们予低[3 mg/(kg·d)]、高浓度[30 mg/(kg·d)]PTE灌胃大鼠，发现低浓度PTE灌胃干预1 d后大鼠来源的BMSCs中CD44阳性细胞(代表细胞循环周期)无显著升高，干预3 d后大鼠来源的BMSCs中CD44阳性细胞显著升高；而来源于高浓度PTE灌胃1 d和3 d后大鼠来源的BMSCs中CD44阳性细胞均显著升高。进一步研究发现，PTE促BMSCs增殖可能与BMP-4上调相关，低(30 μg/mL)、高浓度(300 μg/mL)PTE干预BMSCs 1、3、5 d后，BMP-4表达呈“先升高后降低”的趋势(3 d时达峰值)。此外，宋述财等[9]研究表明，高(3 333 μg/mL)、中(333.3 μg/mL)、低(33.33 μg/mL)剂量PTE通过调控维生素D受体(VDR)、视黄酸受体α(RARα)促BMSCs增殖，且促增殖效果呈剂量依赖性。

有趣的是，龟板对BMSCs增殖存在双向调控作用，即龟板对BMSCs增殖既有促进，又有抑制作用。Wang等[10-11]用乙酸乙酯萃取并通过硅胶柱层析梯度洗脱法分离龟板得到16个组分(Ts-1～16))，发现Ts-12中鉴定出的棕榈酸甲酯(S-1)和肉豆蔻酸胆固醇(S-8)促BMSCs增殖，而Ts-4中的硬脂酸(S-5)抑制BMSCs增殖。张海玲等[12]研究发现，PTE干预BMSCs早期(36 h和3 d)剂量依赖性上调分化抑制蛋白1(Id1)表达，促BMSCs增殖；干预BMSCs晚期(7 d)时，PTE可下调Id1表达，抑制BMSCs过度增殖。张越华等[13-14]发现，龟板石油醚提取物(龟板浸膏)中同时具有促增殖和抑制增殖的物质，十六烷酸在低(0.15 μg/μL)、高浓度(1.5 μg/μL)均可显著促大鼠BMSCs增殖；而龟板浸膏甲酯化产物中的十六烷酸甲酯在低浓度时促BMSCs增殖，但在高浓度时反而抑制BMSCs增殖。然而，以上文献报道中，龟板对BMSCs增殖的影响仅有表型结果，关于龟板对BMSCs增殖的促进或抑制作用的具体起效过程及深层机制尚未完全明确，将来有必要对龟板双向调控BMSCs增殖的量效关系、中间回路及平衡机制进行研究。

1.2 龟板对BMSCs迁移的影响

目前，关于龟板对BMSCs迁移影响的研究较少。黄小兵等[15]证实，龟板含药血清可呈剂量依赖性上调HGF/c-met轴促进BMSCs迁移。笔者研究发现，龟板水提成分可上调SDF-1/CXCR4轴促BMSCs迁移(相关结果待发表)。

1.3 龟板对BMSCs成骨分化的影响

1.3.1龟板调控成骨相关因子诱导BMSCs成骨分化：BMSCs可向成骨细胞方向分化[16]。成骨相关因子碱性磷酸酶(ALP)[17]、Runt相关转录因子2(Runx2)[18]、骨桥蛋白(OPN)[19]、VDR[20]、RARα[21]、BMP-4[22]、Id1[23]与BMSCs成骨分化密切相关。据报道[24]，龟板可显著提高ALP活性、促进钙沉积促BMSCs成骨分化。此外，PTE可上调ALP、Runx2和OCN表达，促成骨分化[25, 26]。侯秋科等[25]证实，PTE上调VDR表达诱导BMSCs成骨分化，且该过程可能与VDR调节BMP通路相关[27]。此外，陈金锋等[28]也证实VDR可能是PTE调控BMSCs成骨分化的作用靶点之一。张海玲等[12]证实，PTE干预BMSCs 7 d时，活化了BMP-4，从而下调Id1(BMP-4靶基因)表达，从而促BMSCs成骨分化。

1.3.2龟板调控miRNAs和信号通路诱导BMSCs成骨分化：miRNA已被证实在OP发病中起重要调控作用[29]。据报道[29]，PTE可能通过“中药小分子物质-miRNA-mRNA-lncRNA”调控网络调控BMSCs向成骨方向分化，PTE通过抑制miRNA-351，上调靶基因VDR表达，从而诱导BMSCs成骨分化。此外，PI3K/AKT[30]、p38 MAPK通路[31]对BMSCs成骨分化起重要作用。笔者证实，PTE(干预浓度为30 μg/mL)可通过调控let-7f-5p/TNFR2/PI3K/AKT轴[26]、p38 MAKP/STE20/IGF1R/TRAF6 轴[33]促BMSCs成骨分化。龟板调控BMSCs增殖、迁移和成骨分化的研究进展见图1。

图1 龟板调控BMSCs增殖、迁移和成骨分化的研究进展Fig.1 Research progress about PT regulating the proliferation, migration, and osteogenic differentiation of BMSCs

2 龟板抗OP的作用及机制

目前临床治疗OP的药物主要为抑制骨吸收药物，因使用过程中存在一些并发症从而限制了其临床运用。龟板长期以来被运用于骨疾病治疗。据报道，龟板可有效抗PMOP、GIOP和SOP。

2.1 龟板抗PMOP

PMOP是因绝经后女性雌激素急剧下降导致的系统性骨病，寻找有效防治PMOP的药物迫在眉睫。实验研究中常运用去卵巢动物模拟临床PMOP患者状态，一些学者探讨了龟板对去卵巢鼠OP的防治作用。王新雨等[34]发现醋龟甲散剂和水煎剂对OP小鼠均有治疗作用，而散剂效果优于水煎剂。孙苏亚等[35]发现，龟板水、醇提取液可显著增加成年去势大鼠骨钙含量和骨生物力学强度。笔者发现，龟板水提成分可促外源性BMSCs归巢从而减少去卵巢大鼠骨丢失，预防PMOP[36]。

2.2 龟板抗GIOP

GIOP是临床最常见的继发性骨质疏松症。本团队在国内外率先开展了龟板防治GIOP的作用及机制研究。本团队证实[37]，龟板可有效改善GIOP大鼠胫骨、腰椎骨密度、骨强度。龟板可能通过降低骨转换逆转GIOP大鼠骨损害[38-39]。此外，龟板单独使用或联合阿伦磷酸钠使用可通过靶向调控Runx2、骨保护素(OPG)和组织蛋白酶K(CTSK)治疗大鼠GIOP[40-41]。龟板还可通过影响let-7f靶向TNFR2调控wnt/β-catenin通路而促BMSCs增殖和成骨分化抗GIOP[42]。

2.3 龟板抗SOP

SOP由增龄等综合因素导致，严重威胁公共健康，挖掘中医药防治SOP的作用机制具有重要价值。研究[43]表明，龟板水提液可有效改善SOP小鼠骨损害，其机制可能与抑制NF-κB转录有关。本团队近期发现，龟板可通过调控“let-7f-海马-HPO轴”抗SOP(相关结果待发表)。

龟板抗PMOP、GIOP和SOP的研究进展如图2所示。

图2 龟板抗OP的研究进展Fig.2 Research progress on the mechanism of PT in anti-osteoporosis

3 总结及展望

综上，龟板可调控BMSCs增殖、迁移和成骨分化，目前研究已初步证实龟板具有抗GIOP、PMOP和SOP的作用。但目前龟板对BMSCs增殖、迁移和成骨分化及抗OP的机制尚未完全明确，仍缺乏相关研究。因此，为进一步阐明龟板抗OP的作用机制，可从以下几个方面开展研究：① 继续优化龟板有效成分的提取方法，进一步提高药效；② 筛选龟板促BMSCs增殖、迁移、成骨分化的信号通路(单一或crosstalk)及相关基因，丰富龟板抗OP的靶点；③ 探讨龟板调控干细胞内分泌/旁分泌效应及干细胞迁移/归巢等生物学行为维持局部微环境平衡抗OP的机制；④ 借助传统分子生物学技术和新型技术(基因芯片和高通量测序)进一步研究龟板对成骨、破骨、血管形成、胶原形成、炎症/免疫、细胞自噬/凋亡/巨噬细胞极化、干细胞外泌体和铁死亡等的调控机制。通过以上研究，全面诠释龟板通过多靶点、多途径、多层次抗OP的机制，为阐明龟板抗OP的机制奠定实验及理论基础。