从外泌体探讨“肾主骨生髓”理论与骨质疏松症的关系

郭澜 李莉 葛继荣

1.福建中医药大学，福建 福州 350003 2.福建省中医药科学院，福建 福州 350003

骨质疏松症(osteoporosis, OP)是一种以骨量降低和骨组织微结构改变，以致骨脆性增加，易发生骨折为特征的全身性骨骼疾病[1]。早期调查显示[2]，在我国50岁以上人群中，女性骨质疏松症发病率达20.7%，男性达14.4%。随着我国人口老龄化程度的不断加剧，骨质疏松症的发病率也呈逐年上升趋势。原发性骨质疏松症属于中医的“骨痿”“骨枯”等范畴，基本病机为肾虚精亏[3]。肾之精气对骨骼的生长发育起到了至关重要的作用，用肾主骨生髓、肾藏精等理论指导中医药对骨质疏松症的防治，起到了较好的临床疗效。通过现代分子生物学研究，“肾主骨生髓”理论得到了部分的科学证实，但对其内涵的理解有待更进一步的研究。外泌体是一类大小在30～120 nm，含有核酸、脂质以及蛋白质等物质的膜封闭的细胞外囊泡[4]。外泌体被其他细胞摄取后，可以实现不同细胞间的物质交流和通讯，并且能通过影响受体细胞的信号通路，来改变周围的微环境[5-6]。近年来研究发现，外泌体可以调节骨代谢，与骨质疏松症有着密切的关系。本文旨在通过外泌体在骨代谢中的作用特点，探讨“肾主骨生髓”理论与骨质疏松症的关系，以此丰富“肾主骨生髓”理论的内涵，也为其指导OP的防治提供新的研究思路。

1 “肾主骨生髓”理论与OP的关系

1.1 现代对“肾主骨生髓”理论的认识

“肾主骨生髓”理论最早见于《黄帝内经》，其中《素问·阴阳应象大论》曰：“肾生骨髓”；《素问·痿论》曰:“肾主身之骨髓”。肾精封藏于肾中，可以化生骨髓以滋养骨骼，并且促进骨骼生长发育。若肾精亏虚，骨髓生化无源，便会导致骨骼失养，出现骨软无力，骨质脆弱，临床可见全身疼痛，易于骨折等OP的表现。因此，肾主骨生髓理论是中医对OP最基础及最具有概括性的认识。中医所讲之肾，具有藏精，促进人体生长发育、生殖和脏腑气化等生理机能，并不仅仅是西医解剖中指的肾脏。现代研究中，主要是通过肾脏对钙磷代谢的调节、肾脏分泌的1-α羟化酶的活性，以及影响下丘脑-垂体-靶腺轴的各种调节因子来理解“肾主骨生髓”理论[7]，这些调节因子被认为是“肾主骨生髓”理论的物质基础。

其中1,25-(OH)2D3是一种类固醇激素,可调节钙磷的代谢, 促进骨基质中有机质的形成[8]；促红细胞生成素(EPO) 主要是促进原始红细胞的生成, 促进骨髓内质网红细胞的释放,还可在体外诱导骨髓间充质干细胞(bone- marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)的成骨分化[9]；骨形态发生蛋白 7(BMP-7)[10-11]可增强BMSCs的成骨分化能力,并且可以与胰岛素样生长因子(insulin like growth factor,IGF)、甲状旁腺素(parathyroid hormone,PTH)等一同促进骨骼的重塑。通过对这些调节因子的研究，从现代分子生物学角度对“肾主骨生髓”理论有了进一步的证实，使运用补肾法防治骨相关疾病更具科学性。但是，这些调节因子大多是肾脏自身所分泌的，用于理解“肾主骨生髓”理论太过于局限，并不能很好地体现中医的整体观念。

1.2 “肾主骨生髓”理论与BMSCs

BMSCs属于多功能细胞，在维持骨量中起着重要作用。BMSCs通过诱导可分化为骨细胞、软骨细胞，脂肪细胞等，可促进骨骼形成，但其成骨分化的能力，会随着年龄的增加而减弱[12]，这与肾精的特点是一致的。目前，在对运用补肾药物防治骨质疏松症的作用机制研究中，促进诱导BMSCs的成骨分化，是众多作用机制之一。王和鸣等[13]用中药巴戟天的醇提物及水提物制备含药血清，加入到用经典成骨诱导方法所培养的BMSCs培养基中,发现补阳药巴戟天能够促进 BMSCs的成骨分化。陈云刚等[14]通过研究发现，补肾药骨碎补的含药血清可以通过激活wnt/β-catenin细胞通路，来促进BMSCs的成骨分化。高璐等[15]将补肾药淫羊藿、补骨脂、何首乌等的有效成分提取物制备含药血清，培养大鼠BMSCs后发现细胞增值率与成骨分化能力都得到提高，其机制与补肾药能够上调RUNX2、OSX的基因表达有关。张玉卓等[16]分别将滋阴补肾代表方左归丸、温肾补阳代表方右归丸的含药血清干预大鼠BMSCs，结果发现左归丸、右归丸均能一定程度地促进BMSCs的成骨分化。这些研究表明，补肾中药、温肾阳及养肾阴类方剂可以促进BMSCs向成骨细胞分化，从而调节骨代谢、增加骨量以治疗骨质疏松症。在中医“肾主骨生髓”的理论中，肾精的作用尤为关键。肾精一部分化为生殖之精，维持机体正常的生长发育与生殖机能，另一部分则化髓充养骨齿。BMSCs的功能与肾精的作用存在类似之处，可通过BMSCs的成骨分化来进一步理解肾主骨生髓理论的内涵。

2 外泌体与OP的关系

2.1 外泌体的研究现状

外泌体是细胞分泌的具有稳定双层膜结构的具膜小体，尺寸在 30～120 nm之间，可以选择性地包裹大量生物活性物质，如蛋白质、脂质和核酸等[17]。外泌体首次于1987年在绵羊的网织红细胞中发现[18]，之后在树突状细胞[19]、T细胞[20]、B细胞[21]等中都相继有发现。在进入细胞外微环境后，外泌体可通过膜融合的方式，将包裹的物质传递到受体细胞中，进行物质的交流和传递，是细胞间通讯的重要介质[22]。有研究表明[23-24]，骨重塑受到包裹在外泌体中关键因子的调节。越来越多的证据表明[24]，由外泌体介导的破骨细胞和成骨细胞之间平衡的双向信号传递，克服了病理性破坏性骨疾病导致的骨丢失。因此，用外泌体防治骨质疏松症具有很大的研究前景。

2.2 外泌体各成分对OP的影响

外泌体内含蛋白质、DNA、mRNA、microRNA等多种成分[25]。Xu等[26]首次报道了在BMSCs成骨分化过程中分泌的外泌体中含有miRNA，他们发现与其他来源的外泌体相比，其中miR-199B、miR-218、miR-148 A、miR-135B、miR-203、miR-219、miR-299-5p和miR-302B显著上调。其中microRNA hsa-miR-135B可促进BMSCs的成骨分化；miR-218以及Wnt信号通路，可以通过信号放大的方式促进人脂肪干细胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)的成骨分化[27]。既往研究已证实，外泌体中的miR-214广泛参与骨形成及吸收过程[28-29]，miR-133 可参与调节BMSCs的成骨分化过程[30]。Lu等[31]报道，ADSCs来源的外泌体中包含了Wnt-3a蛋白，能够增强人类初代成骨细胞的增殖能力和成骨分化能力，其中的 Wnt蛋白被报道与骨再生和骨环境的稳态具有十分密切的关系[32]。并且，Li等[33]将AdSCs来源的外泌体植入小鼠颅骨缺损模型中，在显微 CT下观察到了成骨的效果。

2.3 外泌体对BMSCs的影响

众多研究表明，外泌体对骨代谢的影响主要是通过调节BMSCs的成骨分化。Cui等[34]提取成骨细胞分泌的外泌体，并与BMSCs共同培养，结果发现BMSCs表面RUNX2基因的表达以及碱性磷酸酶都显著上调，这说明成骨细胞来源的外泌体能增强BMSCs成骨分化能力。人单核细胞分泌的外泌体对BMSCs也具有促成骨分化作用，该类外泌体与BMSCs共培养后，其细胞表面的成骨标志基因RUNX2、骨形态发生蛋白-2的表达与对照组相比显著增加[35]。人树突状细胞来源的外泌体对BMSCs的成骨分化亦有显著促进作用，经其作用后的 BMSCs碱性磷酸酶的活性增强，成骨分化特异性转录调节因子RUNX2表达增加[36]。

2.4 干细胞来源的外泌体对OP的影响

非干细胞来源的外泌体，可以促进BMSCs的成骨分化，而研究表明干细胞来源的外泌体也能够影响骨代谢。研究[37-38]发现，移植的外源性BMSCs分泌的外泌体可以通过调控宿主BMSCs的成骨分化功能，逆转骨质疏松，近期研究[39]发现，移植外源性细胞通过分泌外泌体影响宿主细胞的功能。宋子珺等[40]发现小鼠ADSCs分泌的外泌体，可以减少处于低氧缺血环境下的骨细胞凋亡，这表明ADSCs分泌的外泌体可以加快骨组织修复与再生。ADSCs来源的外泌体(ADSC-Exos)在成骨诱导的环境下能在体内及体外促进BMSCs向成骨细胞分化[41]。朱梦茹等[42]报道，不同分化阶段分泌的ADSC-Exos形态特征略有不同，ADSC- Exos能够被原始ADSCs高效摄取进入细胞内发挥作用，成骨预处理的ADSC-Exos能够于体外独立诱导原始ADSCs成骨分化。ADSCs-Exos能够有效地促进人的初代成骨细胞(human primary osteoblastic cells，HOBs)增殖和分化为成骨细胞[31]，主要是通过增强Wnt-3a信号通路的表达，从而促进HOBs向成骨细胞分化，达到骨修复和再生的目的。Qi等[43]将人诱导的间充质干细胞所分泌的外泌体(hiPSC-MSC-Exos)与通过去除卵巢造模成功的OP大鼠的骨髓间充质干细胞(rBMSCs-OVX)一同培养，结果发现hiPSC-MSC-Exos 可以促进rBMSCs-OVX的增殖和成骨分化能力，并且增加外泌体的浓度，rBMSCs-OVX的成骨分化能力也相应得到提高。

3 从外泌体探讨运用“肾主骨生髓”理论防治OP

用中医“肾主骨生髓”理论指导骨相关疾病，特别是对OP的防治，在临床上已取得较好的疗效。结合现代分子生物学的研究，可以更好的理解、扩展该理论的内涵，使其更好地指导临床。但对中医肾的理解不能局限于西医之肾脏，对“肾主骨生髓”理论的研究也不能局限于肾脏所分泌的物质。BMSCs的成骨分化在骨代谢中起到了非常关键的作用，其功能与促进机体生长、发育、生殖的“肾精”类似。肾精来源于先天之精，受后天之精的充养。肾藏精，精化气，气分阴阳，则为肾阴与肾阳。BMSCs与肾阳、肾阴在功能方面皆有联系。肾阳能推动及激发脏腑各项机能，骨骼的生长发育也有赖于肾阳的推动，肾精促进机体生长发育最主要的表现在于肾气推动骨骼的发育，概括为“肾主骨”；BMSCs能分化为成骨细胞，直至骨细胞，从而促进骨形成及维持骨的基本结构，与肾阳的部分功能相通。肾阴可以凉润脏腑形体官窍，肾阴足则有充足的津血以濡养骨骼，精生髓，髓居于脑及骨中，居于骨为骨髓，骨髓滋养骨，才能使骨骼保持坚固有力，维持骨的正常生理功能，且肾精能化赤为血，给骨骼提供充足的营养；BMSCs来自于骨髓之中，与造血微环境相关，可促进造血干细胞的造血功能[44]。因此，肾精及“肾主骨生髓”理论与BMSCs存在密切的关联。

现代研究中，BMSCs的功能及分化受到众多因子的调控，其中外泌体是一大影响因子。且外泌体对OP的影响主要是通过促进BMSCs的成骨分化及调节成骨细胞和破骨细胞的动态平衡来实现的。特别是BMSCs来源的外泌体，对骨代谢的影响较为显著。外泌体与既往研究中作为肾主骨生髓理论物质基础的相关因子类似，可以通过细胞间的信息传递来调节细胞的生理机能。在“肾主骨生髓”理论指导下运用补肾药物及方剂治疗OP取得了一定的临床疗效，对其具体的作用机理也有相关研究，且主要是与BMSCs的成骨分化相关，但对于如何调控BMSCs的成骨分化方面研究不够深入。外泌体对BMSCs的成骨分化的影响已有较为明确的研究证实，且具有影响作用的外泌体还包括非BMSCs所产生，这与“肾主骨生髓”理论中肾对机体的调控是全身性的相一致。因此，可以通过外泌体来探讨“肾主骨生髓”理论与OP的关系，为运用补肾法防治OP提供新的研究思路，也使“肾主骨生髓”理论可以更好的被现代医学所理解和认可。

4 总结与展望

通过对“肾主骨生髓”理论与OP的关联性出发，根据外泌体在骨代谢中的生物学功能上与BMSCs关系密切并且与肾的生理功能存在一定的相关性，说明可以通过外泌体来探讨“肾主骨生髓”理论防治OP的科学性。通过外泌体加深对“肾主骨生髓”理论的研究，丰富其内涵，促进中医理论与现代研究相结合，为OP的防治提供更多的思路与指导。通过现代分子生物学研究来理解中医理论可以使得中医经典理论更具科学性，但终究不能完全体现中医理论的内涵。希望在今后的研究中，会有更好的办法可以深入挖掘中医理论的内涵，使其得到更好的传承和发展。