杜仲诱导骨髓间充质干细胞成骨分化防治骨质疏松症相关信号通路研究进展

赵继荣 杨涛 赵宁 马同 薛旭 李玮农 张立存

1.甘肃省中医院，甘肃 兰州 730050 2.甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730030

骨质疏松症(osteoporosis,OP)是一种因骨密度降低和骨组织微结构破坏导致的骨骼强度减低而易发生骨折的慢性骨代谢性疾病[1]。现已成为全球主要的公共卫生问题，具有较高的发病率和严重的死亡率。据统计，全世界约2亿妇女受其影响，由骨质疏松引发的骨折每年可高达890万次以上。而在中国，骨质疏松症影响着近700万50岁以上的中国人，并且每年会造成近69万例髋部骨折[2]。因而对于OP的发病机制及诊疗方法的探究一直是一个研究热点。现代医学对OP研究已经深入到分子学水平，认为由破骨细胞介导的骨吸收与成骨细胞介导的骨形成的偶联平衡被打破致使骨吸收大于骨形成是引发骨质疏松的主要发病机制[3]。故上调骨形成或抑制骨吸收是治疗OP的重要原则。中医将OP称之为“骨萎”，根据经典理论“肾主骨生髓”常治疗以“补肾益髓”之法。多年来，研究人员在此理论指导下结合骨组织工程及细胞培养等高新技术，在OP的基础研究及临床治疗方面成果显著。本文作者查阅大量国内外相关文献，兹就传统中药杜仲诱导骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)向成骨细胞分化从而防治OP的相关信号通路研究作以综述，以期为该病临床诊疗提供新思路,从而造福广大OP患者。

1 杜仲-骨质疏松症相关研究

杜仲为杜仲科植物杜仲(eucommia u1moides oliv.)的干燥树皮，性甘温，归肝、肾经，具有补肝肾，强筋骨，安胎之效[4]。作为我国传统中药，在临床实践中已使用两千多年，神农本草经列为上品，曰其“主治腰膝痛，补中，益精气，坚筋骨”[5]。现代研究[6]显示杜仲皮、叶、花、种子不同部位含有木脂素类、环烯醚萜类、黄酮类、萜类、甾体类、酚酸及多糖类等大约205种化学成分，并且现代药理学研究发现其具有预防骨质疏松、降血糖、控血压、调血脂、保肝、抗肿瘤、抗炎等多种药理活性。而近年来研究最多的则是其用于治疗骨质疏松症。大量研究表明杜仲的水、醇提取物或者含药血清能够促进成骨细胞增殖，激活骨重建，改善骨代谢，防治OP。碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(BGP)、骨保护素(OPG)及Ⅰ型前胶原C-端前肽/N-端前肽(PICP/PINP)均为骨形成标志物，能够反映成骨细胞的活性[7]。方宁等[8]采用不同浓度梯度的杜仲叶提取物对大鼠成骨细胞进行干预，发现杜仲叶提取物可以通过促进骨钙素(BGP)的表达而影响成骨细胞的增殖，且呈现浓度依赖性。翁泽斌等[9]使用杜仲及其盐制品对去卵巢雌性大鼠进行干预，发现杜仲生品及盐制品在抑制血钙降低的同时能够升高血磷、ALP和BGP，从而降低高骨转换率，发挥治疗OP的作用，且盐制杜仲效果更优。另外曹旭等[10]采用杜仲不同浓度的含药血清对小鼠MC3T3-E1 Subclone 14成骨细胞进行干预，发现杜仲含药血清能够促进成骨细胞增殖，增加ALP的分泌，上调OPG/RANKL系统以改善骨重建和骨平衡。胡倩影等[11]研究发现杜仲有效成分松脂素二葡萄糖苷能够促进OPG的分泌来抗骨质疏松，松脂素则既能通过促进OPG分泌又能通过抑制RANKL表达来发挥作用。除了上述及大量研究证实了杜仲可作用于成骨细胞，促进成骨细胞增殖，增加其活性，发挥抗骨质疏松作用外，还有研究表明杜仲能够诱导BMSCs增殖及向成骨细胞定向分化，从而发挥抗骨质疏松作用，但是其具体分子机制及信号转导通路尚不清楚，存在争议。

2 杜仲-BMSCs成骨分化-骨质疏松症相关信号通路研究

骨质疏松症发病机制主要是因为成骨细胞与破骨细胞平衡被打破，骨吸收大于骨形成，因而成骨细胞在抗骨质疏松中起至关重要的作用。研究发现成骨细胞主要来源于BMSCs。20世纪70年代Friedenstein等[12]首次从大鼠骨髓中分离出BMSCs，并发现此细胞可以向骨细胞分化，此后Crapnell等[13]研究发现BMSCs可以很容易地在体外环境进行扩增，Bianco等[14]在体内实验中发现BMSCs具有较强的自我更新能力。后来研究[15]发现BMSCs具有多项分化的潜能，在一定诱导条件下，可以分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经细胞、心肌细胞等。因为具有较强的自我更新能力，能够在离体条件下扩增且具有多项分化的潜能，BMSCs成为了细胞治疗和组织工程中有用的工具。

近年来，使用中药制剂诱导BMSCs 向成骨细胞分化来防治OP受到广泛的关注，成为临床研究和实验研究的热点之一。诱导BMSCs分化为成骨细胞是一个高度复杂且程序化的过程，在多种信号分子的共同作用下，BMSCs首先产生骨前体细胞，随后依次形成骨原细胞、前成骨细胞、功能性骨形成细胞，最后形成成熟骨细胞[16]。临床多使用地塞米松、β-甘油磷酸钠和维生素C组合作为成骨诱导剂。而近年来研究发现传统补肾中药杜仲提取物或其含药血清可以作为BMSCs成骨分化的诱导剂，而其发挥作用的机制涉及Wnt/β-catenin、MAPK、RhoA/ROCK等多种信号通路，下面对其进行阐述。

2.1 杜仲对Wnt/β-catenin 信号通路调控研究

Wnt信号通路为目前骨代谢相关疾病发病机制的研究热点。Wnt参与的信号通路包括经典的Wnt/β-catenin途径以及非经典的 Wnt/PCP与 Wnt/Ca2+途径[17]。其中经典Wnt/β-catenin信号通路是调节骨骼发育和维持骨骼内稳态的重要信号调节通路[18]。该信号通路由Wnts蛋白、低密度脂蛋白相关受体蛋白5/6(LPR5/6)、卷体蛋白(frizzled,Frz)、糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)、散乱蛋白 (dishevelled, Dsh)、β-链蛋白 (β-catenin)、结直肠腺瘤性息肉蛋白 (APC)、轴蛋白(Axin)和核内转录因子T细胞因子(TCF)/淋巴样增强因子(LEF)等几种蛋白质构成[19]。Wnt/β-catenin信号通路主要通过调控成骨细胞定向分化和特异性基因的表达，增强成骨细胞的活性，促进细胞外基质的矿化，促进骨形成，调控骨重建。

研究发现杜仲可以诱导BMSCs向成骨细胞分化来治疗OP。张贤等[20]用杜仲醇提取物对第3代SD大鼠BMSCs进行干预，采用荧光定量PCR法检测杜仲诱导BMSCs向成骨细胞分化过程中Wnt信号通路中多种相关因子的表达变化，发现与阴性对照组比较，诱导3 d后Fzd2表达升高11.86倍，Fzd3升高达到2倍；诱导7 d后，Fzd2表达升高5.12倍，Fzd3恢复到正常水平；β-catenin 在诱导3 d 时表达升高达2倍；WIF1在诱导3 d和7 d后表达显著下降，说明杜仲诱导BMSCs成骨分化主要与上调Wnt/β-catenin 信号通路中的Fzd2、Fzd3、β-catenin蛋白受体，下调Wnt蛋白抑制因子WIF1因子相关。汤军等[21]采用杜仲醇提取物对大鼠BMSCs进行诱导，发现Fzd受体参与了杜仲诱导BMSCs成骨分化的过程，响应时间出现在第3天。综上所述，杜仲诱导BMSCs成骨分化主要是通过对Wnt/β-catenin 信号通路的调控，主要与Fzd2及Fzd3受体、β-catenin蛋白、WIF1因子有关。

2.2 杜仲对MAPK信号通路调控研究

丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)是存在于一系列哺乳动物中的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是细胞外刺激到细胞核的重要传递者，是参与细胞分化、细胞增殖、细胞死亡和细胞运动等多方面的重要信号转导酶[22]。其家族包括细胞外信号调节激酶(extracellular-signal regulated kinase,ERK1/2)、c-Jun 氨基端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)、p38MAPK三种蛋白激酶[23]。ERK是最早被发现的MAPK信号通路，包括ERK1及ERK2两种亚型，两种均在成骨细胞中表达，p38MAPK具有p38α、p38β、p38γ和p38δ四种亚型，JNK信号通路共有JNK1、JNK2、JNK3三种亚型，其中JNK1和JNK2普遍表达，而JNK3的表达较局限，主要存在于神经元中[24]。MAPK信号转导主要是通过三级酶促级联反应进行，首先MAP3K磷酸化MAP2K，被磷酸化激活的MAP2K中存在针对下游MAPK128的MAPK对接结构域，确保了MAP2K磷酸化激活MAPK的特异性，被活化的MAPK磷酸化激活下游多种靶基因的表达[25]。近年来，多项研究表明MAPK信号通路在促进BMSCs成骨分化改善OP的过程中发挥了至关重要的作用。Yang等[23]研究发现葛根中的主要异黄酮类化合物葛根素能够使ERK1/2和p38磷酸化，从而诱导BMSCs成骨分化。Song等[26]研究发现淫羊藿主要活性黄酮苷即淫羊藿苷可迅速诱导ERK和JNK活化，从而使成骨细胞增殖。

研究发现补肾中药杜仲诱导BMSCs成骨分化与MAPK信号通路密切相关。张立超等[27]研究发现杜仲叶提取物可以激活MAPK/ERK磷酸化活性来促进大鼠成骨细胞增殖。陈林攀等[28]用杜仲叶提取物槲皮素对SD 大鼠第三代BMSCs进行干预，Western blot结果显示槲皮素能够提高ERK的磷酸化水平，在促进成骨细胞增殖的同时，激活Shp2，活化ERK信号通路从而促进大鼠 BMSCs 增殖和成骨分化。

2.3 杜仲对RhoA/ROCK信号通路研究

在BMSCs成骨分化的进程中，细胞骨架会发生改变，而Ras同源基因/Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶(RhoA/ROCK)信号通路是调控细胞骨架的关键信号通路之一。Rho蛋白包括Rho A、Rho B、Rho C、Rho D、Rho E五种亚型，属于小G蛋白家族，其中Rho(A-C)具有高度同源性。当Rho与鸟嘌呤二核苷酸磷酸(GDP)结合时处于失活状态，与鸟嘌呤三核苷酸磷酸结合时被激活，ROCK是Rho的主要下游靶基质，包括ROCK1和ROCK2两种亚型，多项研究表明RhoA/ROCK信号通路在BMSCs成骨分化过程中发挥着重要作用。Zhang等[29]研究发现二甲氧甘氨酸通过激活RhoA/ROCK信号通路能够促进BMSCs成骨分化。Yang等[30]研究表明RhoA/ROCK信号通路可能通过介导细胞骨架变形来促进BMSCs的成骨分化。Saidova 等[31]认为RhoA/ROCK信号通路无论是通过增加张力还是通过从动态微管中释放出的FGF-H1的激活都有利于成骨，并抑制BMSCs向软骨细胞及脂肪细胞分化。

研究发现中药杜仲可通过RhoA/ROCK信号通路诱导BMSCs的成骨分化。林奇生等[32]用杜仲醇提取物对OP大鼠模型进行灌胃干预，发现杜仲中高剂量组大鼠ROCK1、RhoA mRNA表达量、BMSCs成骨诱导后骨桥蛋白 (OPN)、Runt相关转录因子2 (Runx2)、骨钙素 (OCN) mRNA表达显著升高，这表明杜仲醇提取物能够促进BMSCs增殖及成骨分化。

3 总结与展望

OP作为全世界面临的重大公共卫生健康问题，现代分子生物学研究认为由成骨细胞介导的骨形成与破骨细胞介导的骨吸收形成的偶联平衡被打破致使骨吸收大于骨形成是其主要发病机制，故而促使成骨细胞增殖可有效防治OP。而BMSCs作为一种多潜能干细胞，是成骨细胞的前体细胞，在一定诱导条件下可向成骨细胞定向分化。中国医药学是一个伟大的宝库，中医学称OP为“骨萎、骨枯、骨极”，在中医经典理论“肾主骨生髓”指导下，常用以补肾中药来治疗OP。近年来，研究人员将此理论与骨组织工程及细胞培养等高新技术相结合，发现传统补肾中药杜仲能够有效防止OP，其机制可能与诱导BMSCs增殖及向成骨细胞定向分化，重新建立骨吸收与骨形成的偶联平衡相关。而其诱导BMSCs成骨分化机制涉及Wnt/β-catenin、MAPK及RhoA/ROCK等多种复杂的信号通路。目前研究发现杜仲能够上调Wnt/β-catenin 信号通路中的Fzd2、Fzd3、β-catenin蛋白受体，下调Wnt蛋白抑制因子WIF1因子，能够激活Shp2，活化ERK信号通路，并且能够影响RhoA/ROCK信号通路中ROCK1、RhoA mRNA表达量、BMSCs成骨诱导后骨桥蛋白 (OPN)、Runt相关转录因子2 (Runx2)、骨钙素 (OCN) mRNA表达，从而诱导BMSCs向成骨细胞定向分化，发挥防治OP的作用。

许多传统的中草药已经在临床实践中使用了数千年，它们被证明有效，适应症广泛，安全性高，但是其复杂的化学成分导致其物质基础及作用机制不明确，这成为制约中药走向世界的瓶颈问题。杜仲皮、叶、花、种子不同部位含有大约205种化学成分，其防治OP物质基础及作用机制有待进一步探索，这就需要结合现代科技手段，融合生物、化学、信息等多学科，发现其在治疗OP中的新靶点、新物质及新机制，让其走向世界，造福于人类。