二甲双胍对地塞米松作用下SD大鼠骨密度的影响及可能的机制

丁钦佩 张书 郭昕彤 梁敏

广西医科大学第一附属医院，广西 南宁530021

糖皮质激素(glucocorticoids,GCs)是临床上广泛使用的一类药物，长期使用会产生严重的副作用，包括糖皮质激素性骨质疏松(glucocorticoid-induced osteoporosis，GIOP)[1]。GIOP已成为继发性骨质疏松中最常见的类型。双膦酸盐类药物是治疗GIOP的一线用药，其作用机制主要为抑制骨吸收，长期应用会导致骨微损伤蓄积[2]。因此临床上迫切需要新的药物来治疗GIOP。二甲双胍为临床上治疗2型糖尿病的一线用药。但二甲双胍对骨骼的影响仍有争议[3]。本课题组前期的研究[4]发现，二甲双胍能够提高SD大鼠的骨密度(bone mineral density,BMD)。本次研究旨在探讨不同干预剂量和时间的二甲双胍对地塞米松作用下SD大鼠BMD的影响及其可能的机制。

1 材料和方法

1.1 材料

72只SPF级3月龄雌性SD大鼠，体重(240±10) g，购买于广西医科大学实验中心，合格证号：SCXK桂2014-0002。大鼠分笼喂养，每笼不超过6只。饲养条件：室温环境，空气流通，标准颗粒饲料专人喂养，自由进水摄食。地塞米松磷酸钠注射液购自天津金耀药业有限公司；盐酸二甲双胍购自美仑生物；水合氯醛购自成都市科龙化工试剂厂；大鼠I型胶原C端肽(CTX-I)及骨钙素(OCN)酶联免疫试剂盒均购自武汉华美生物工程有限公司。

1.2 方法

大鼠适应性喂养1周后随机分为6组(每组12只)：对照组、地塞米松组、二甲双胍100(Met 100)、200(Met 200)、300(Met 300)、500(Met 500)mg组。对照组每周肌内注射生理盐水2次，每天生理盐水灌胃1次；地塞米松组每周肌内注射5 mg/kg的地塞米松2次，每天生理盐水灌胃1次；各二甲双胍组每周均肌内注射5 mg/kg的地塞米松2次，每天分别给予100、200、300、500 mg/kg的二甲双胍灌胃1次。药物干预12周，每2周测体重1次并调整药物用量。在实验前及药物干预后4、8、12周，使用Lunar公司的PLODIGY型双能X线骨密度仪(附带小动物软件)测定大鼠全身BMD及体成分。测量前用10 %的水合氯醛依照3 mL/kg的用量进行腹腔注射麻醉。在实验结束处死大鼠前，行腹主动脉取血，离心后取上清。部分血样用来检测CTX-I及OCN，严格依照酶联免疫试剂盒说明书进行操作。另一部分血样送至广西医科大学第一附属医院检验科，使用全自动生化分析仪检测血钙、血磷、碱性磷酸酶(ALP)、血糖、总胆固醇(CHO)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 大鼠全身BMD的变化

药物干预前及干预4周时，各组间的BMD比较差异无统计学意义(均P>0.05)。干预8周时，地塞米松组、Met 200、Met 300及Met 500组BMD均低于对照组(均P<0.05)；Met 100组BMD低于对照组，但差异无统计学意义(P>0.05)；各地塞米松联合二甲双胍组与地塞米松组相比，BMD无统计学的差异(均P>0.05)。干预12周时，地塞米松组和各地塞米松联合二甲双胍组的BMD均低于对照组(均P<0.05)；Met 100、Met 200组的BMD均高于地塞米松组及Met 500组(均P<0.05)。详见表1。

表1 各组大鼠不同时间点全身骨密度的比较Table 1 Comparison of total bone mineral density at different time points among six

2.2 大鼠全身脂肪组织含量的变化

干预前，各组间脂肪组织含量比较差异无统计学意义(P>0.05)。干预4、8及12周时，地塞米松组和各地塞米松联合二甲双胍组的脂肪含量均低于对照组(均P<0.05)；但各地塞米松联合二甲双胍组与地塞米松组相比，脂肪组织含量比较差异无统计学意义(均P>0.05)。详见表2。

表2 各组大鼠不同时间点全身脂肪组织含量的比较Table 2 Comparison of total fat mass at different time points among six

2.3 大鼠全身肌肉组织含量的变化

干预前，各组肌肉组织的含量比较差异无统计学意义(P>0.05)。干预4、8、12周，地塞米松组和各地塞米松联合二甲双胍组的肌肉组织含量均低于对照组(均P<0.05)。干预4周，Met 100、Met 300组及Met 500组的肌肉组织含量均低于地塞米松组(均P<0.05)；Met 200组的肌肉组织含量高于Met 500组(P<0.05)。干预8周，Met 200组的肌肉组织含量高于地塞米松组、Met 500组及Met 100组(均P<0.05)。干预12周，Met 200组的肌肉组织含量高于地塞米松组及Met 500组(均P<0.05)。详见表3。

表3 各组大鼠不同时间点全身肌肉组织含量的比较Table 3 Comparison of total lean mass at different time points among six groups (g,

2.4 大鼠体重的变化

干预前，6组之间的体重比较差异没有统计学意义(P>0.05)。在干预12周的过程中，对照组(control)体重逐渐上升，而其余各组体重较稳定并呈逐渐下降趋势。干预2周，Met 500组体重低于对照组(P<0.05)。干预4周至12周，各时间点地塞米松组(dex)及各地塞米松联合二甲双胍组的体重均低于对照组(均P<0.05)；其余各组在各时间点体重比较差异均无统计学意义(均P>0.05)。见图1。

图1 各组在12周实验过程中体重的变化情况Fig.1 Body weight changes of six groups during the 12-weeks experimental period

2.5 大鼠血CTX-I和OCN的变化

与对照组(control)相比，地塞米松组(dex)、Met300、Met 500组的CTX-I显著升高(均P<0.05)；与地塞米松组相比，Met 100、Met 200及Met 300组的CTX-I显著降低(均P<0.05)；Met 100及Met 200组的CTX-I均低于Met 500组(均P<0.05)。除Met 100组外，其余各组的OCN均低于对照组(均P<0.05)；与地塞米松组相比，Met 100、Met 200及Met 300组的OCN均升高(均P<0.05)；Met 200、Met 300 及Met 500组的OCN均低于Met 100组(均P<0.05)。见图2。

图2 血CTX-I和OCN浓度注：a：CTX-I；b：OCN。与对照组比较，*P<0.05；与地塞米松组比较，&P<0.05；与Met 500组比较，#P<0.05；与Met 100组比较，ΔP<0.05。Fig.2 The serum concentration of CTX-I and OCN

2.6 大鼠血生化指标的变化

Met 300组的血钙低于Met 500组(P<0.05)，其余各组之间血钙无差异(均P>0.05)。各组间血磷比较差异无统计学意义(P>0.05)。地塞米松组(dex)、Met 200、Met 300及Met 500组的ALP均低于对照组(control)(均P<0.05)；Met 100、Met 200及Met 300组的ALP均高于地塞米松组(均P<0.05)；Met 100组及Met 300组的ALP高于Met 500组(均P<0.05)；Met 200组的ALP低于Met 100组(P<0.05)。地塞米松组、Met 300组及Met 500组的血糖均高于对照组(均P<0.05)；各地塞米松联合二甲双胍干预组的血糖与地塞米松组相比，比较差异均无统计学意义(均P>0.05)。地塞米松组和各地塞米松联合二甲双胍组的CHO及HDL-C均低于对照组(均P<0.05)；各地塞米松联合二甲双胍干预组的CHO、HDL-C与地塞米松组相比，比较差异均无统计学意义(均P>0.05)。地塞米松组的TG比对照组高(P<0.05)；各地塞米松联合二甲双胍干预组的TG与地塞米松组相比，比较差异均无统计学意义(均P>0.05)。各组间LDL-C比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见图3。

图3 血生化指标的浓度注：a：血钙；b：血磷；c：ALP；d：血糖；e：CHO；f：TG；g：HDL-C；h：LDL-C。与对照组比较，*P<0.05；与地塞米松组比较，&P<0.05；与Met 500组比较，#P<0.05；与Met 100组比较，ΔP<0.05。Fig.3 The serum concentration of biochemical indicators

3 讨论

本研究发现二甲双胍可以提高地塞米松作用下SD大鼠的BMD，与Zhao等[5]的结论一致。同时，本研究也发现二甲双胍提高地塞米松作用下SD大鼠的BMD与其干预的时间、剂量有关。一定剂量的二甲双胍干预一定的时间，可以改善地塞米松作用下SD大鼠的BMD。随着二甲双胍剂量的增加，SD大鼠的BMD反而降低，提示需要准确地把握二甲双胍剂量和作用时间才能发挥其对骨骼的有利作用。

地塞米松和二甲双胍均可影响体重及体成分(包括脂肪组织及肌肉组织等)[6-7]。研究[8-10]表明体重及体成分与BMD密切相关。高体重可增加作用于骨骼的承重性外力，进而提高BMD[8,11]。肌肉组织和脂肪组织构成了体重的主要成分，肌肉组织与骨量正相关，而脂肪组织与骨量的关系存在争议[8]。本研究显示，干预12周后，各组大鼠之间体重及体成分的变化趋势与BMD的变化并不一致，表明二甲双胍提高地塞米松作用下SD大鼠BMD的作用可能不依赖于体重及体成分改变。地塞米松可干扰正常的糖脂代谢，导致血糖升高及血脂紊乱[7]。高血糖可通过多种途径损害正常的骨代谢，加速骨量的丢失[12]。血脂水平与骨质疏松也密切相关[13]。本研究显示，地塞米松联合二甲双胍干预组与单用地塞米松组相比，血糖、血脂水平比较差异无统计学意义。这表明二甲双胍对抗地塞米松介导的骨质疏松作用可能与其对糖脂代谢的作用无关。

GIOP的发生机制包括抑制成骨细胞的增殖及分化，促进成骨细胞及骨细胞的凋亡，延长破骨细胞的寿命及活性等，最终使骨形成降低，骨吸收增加[1]。研究[14]显示，二甲双胍可通过经典的AMPK通路诱导成骨细胞增殖、分化及矿化，减少成骨细胞凋亡，也可通过上调骨保护素表达及下调核因子κB配体来抑制破骨细胞活性及分化。骨转换标志物(包括骨吸收和骨形成标志物)是骨骼本身的代谢产物，代表全身骨骼的动态状况[15]。与双能X线测量的BMD相比，骨转换标志物在反映骨量变化方面更加敏感。本研究发现，地塞米松可增加骨吸收标志物CTX-I水平，降低骨形成标志物OCN及ALP水平，而地塞米松联合Met 100、Met 200及Met 300组可部分逆转地塞米松所致的骨吸收增加和骨形成减少，这与Zhao等[5]结论一致。二甲双胍通过增加骨形成和抑制骨吸收改善骨重构，减轻地塞米松造成的骨结构损害，减少骨量丢失，进而抵抗地塞米松造成的BMD下降。此外，GCs可通过抑制肠钙、磷吸收，减少尿钙重吸收等间接作用导致骨质疏松[1]。但本研究显示各组与地塞米松组之间的血钙、磷水平比较差异无统计学意义。一方面是因为血钙、磷容易受各种因素，如血清总蛋白水平、饮食等影响，另一方面可能与单次测量的血钙、磷水平并不能充分反映体内钙、磷代谢的真实情况有关，测定24 h的尿钙、磷可能更有意义。

临床上二甲双胍的疗效与剂量有关，在每天500～2 000 mg的剂量范围内，其效果呈现剂量依赖效应，继续增加剂量其疗效反而降低[16]。在本研究中，干预12周后，二甲双胍对糖、脂及骨代谢指标的影响并没有呈现剂量依赖性，这可能与给药剂量[大鼠200 mg/(kg·d)约相当于人类2 000 mg/(70 kg·d)[17]]、给药频率、给药方式及种属差异等有关。提示在后续的研究中，需要优化给药剂量、频率、方式等，必要时监测二甲双胍的血药浓度，以深入探讨二甲双胍对糖、脂及骨代谢指标的影响与其抗骨质疏松作用的相关性。

综上，本研究显示，二甲双胍可能通过增加骨形成和抑制骨吸收来改善地塞米松作用下SD大鼠的BMD，这一作用不依赖于体重、体成分及糖脂代谢的改变，主要与二甲双胍干预的时间和剂量有关。未来二甲双胍有望成为治疗GIOP的新药。