葛根素诱导脂肪干细胞成骨分化的实验研究

刘永红 陈远明 周昊楠 黄中飞 王珣

1.广西医科大学第二附属医院预防保健科，广西 南宁 5300072.广西医科大学第二附属医院骨科，广西 南宁 5300073.广西中医药大学附属瑞康医院骨科，广西 南宁 530000

雌激素水平下降是绝经后骨质疏松的主要原因[1]。在临床上，发现绝经后骨质疏松患者有一共同现象，即出现椎体骨小梁明显下降以及脂肪明显增加。因此，笔者推测是不是绝经影响了某种干细胞的分化，从而导致成骨减少以及成脂肪增加？有研究发现脂肪干细胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)既可以向成骨分化，又可以向成脂肪分化[2]。女性绝经后体内雌激素水平明显下降[3]，这是否影响脂肪干细胞的分化？雌激素减少引起骨质疏松[4]，但其机制尚有争议，多数学者认为是通过破骨细胞的作用[5-7]。雌激素可以治疗绝经后骨质疏松，但有诱发乳腺癌、增加脑血管意外和静脉血栓栓塞事件的风险[8]。葛根素是从豆科植物野葛或甘葛藤的根中提取得到的异黄酮类化合物，属于植物类激素，与雌激素有相似的化学结构，具有一定的抗绝经后骨质疏松作用[9-14]，但其作用机理目前尚不明确。本实验试图通过体外观察葛根素诱导卵巢切除后大鼠骨质疏松模型的ADSCs成骨分化的能力，评价葛根素抗绝经后骨质疏松效果，旨在开发新的治疗骨质疏松的药物。

1 材料与方法

1.1 实验动物与主要试剂

雌性3月龄SD大鼠，体重(250±25)g，由广西医科大学动物实验中心提供，医学实验动物生产许可证号SCXK(桂)2016-0002。葛根素，产品规格：20 mg(北京索宝生物科技有限公司提供)。大鼠抗体CD45、CD44、CD29、CD11B、CD90，产品规格：50 μg、0.1 mg、50 μg、50 μg、50 μg(美国BD公司提供)。碱性磷酸酶染色试剂盒，产品规格：50 T(上海康朗生物科技有限公司提供)； 碱性磷酸酶活性检测试剂盒，产品规格：100 T(上海翊圣生物科技有限公司提供)。茜素红染色试剂盒，solarbio，货号G1452-100 mL(北京索莱宝科技公司提供)。

1.2 方法

1.2.1绝经后大鼠 ADSCs的分离、培养、传代及鉴定：取饲养3个月后的SD大鼠，采用3%的戊巴比妥钠0.1 mL/100 g通过腹腔注射方式麻醉大鼠，剔除腹部毛发，以碘伏常规消毒，沿腹中线作0.8～1 cm切口，深达腹腔，用镊子轻轻牵起腹腔内组织，找到两侧输卵管结合处，分别沿输卵管找到两侧卵巢，用电凝笔切开输卵管卵巢结合处并切除卵巢及少许周围脂肪，观察无渗血后，将输卵管还纳腹腔，由内向外逐层缝合腹肌和皮肤，取暖器照射复苏，待大鼠苏醒后送回笼中。术后6 h恢复常规饮食，腹腔注射抗生素，持续一周，伤口处涂抹红霉素软膏，预防感染。

术后饲养3个月后，采用3%的戊巴比妥钠0.1 mL/100 g通过腹腔注射方式麻醉大鼠，75%酒精纱布湿敷10 min后，无菌条件下取腹股沟处脂肪置于培养皿，剔除肉眼可见的小血管、包膜及结缔组织，PBS清洗3次去除红细胞，眼科剪持续剪5～8 min，将脂肪组织剪成1 mm3左右大小组织块，冲洗干净，转移至离心管，加入2倍体积的0.075% I型胶原酶，放置在恒温摇床，37 ℃、150 r/min振荡消化1 h；加入等体积完全培养基(低糖DMEM培养基，10%胎牛血清，100 U/mL青霉素，0.1 mg/mL链霉素)中止消化，200目滤网过滤，1 000 r/min离心10 min；去除上清及残留未消化组织；加入完全培养液轻柔吹打，重悬细胞，接种于25 cm2的细胞培养瓶内，轻晃混匀，细胞培养箱设置为饱和湿度，5%C02，37 ℃标准条件。24 h后首次换液，除去未贴壁细胞，之后每2 d换液1次。

传代培养：显微镜下观察细胞，当细胞长满培养瓶底70%～80%后，开始传代。在超净工作台内吸出培养基，加入1 mL的0.25%胰蛋白酶，轻柔晃动培养瓶使胰酶均匀覆盖瓶底，在显微镜下观察到大部分细胞回缩后，拍打瓶身松散细胞，加入完全培养基中止消化，吹打瓶底，转移至离心管，1 000 r/min离心5 min；去除上清，加入完全培养基，轻柔吹打，重悬细胞，将细胞悬液转移至另外两个新的25 cm2细胞培养瓶，轻柔晃动使细胞均匀铺满瓶底。通常5～7 d后可再次长满瓶底70%～80%，同样的方法进行传代，显微镜下观察ADSCs的形态。

鉴定：分别取第3代和第21代卵巢切除组的ADSCs行免疫荧光化学染色，一抗为 CD11b、CD29、CD45、CD44、CD90，阴性对照组加入PBS代替一抗对照，步骤如下：(1)细胞计数后取105个细胞，1 200 r/min离心5 min，弃上清液。(2)加入50 μL PBS重悬，按以下分组加入免疫荧光染料： A：5 μL PE-CD90，5 μL FITC-CD29，5 μL APC-CD11b，5 μL PE-Cy7-CD45；B：5 μL PE-CD90，5 μL FITC-CD44，5 μL APC-CD11b，5 μL PE-Cy7-CD45；C：20 μL PBS。(3)将细胞与抗体用移液器轻柔混匀，室温下避光孵育30 min。(4)每组加入1 mL PBS，1 200 r/min离心5 min，弃上清液。(5)加入500 μL PBS重悬后，使用流式细胞仪进行检测，比较差异，分析结果。

1.2.2测定葛根素的无毒剂量：取第3代对数生长期的ADSCs，0.25%胰酶消化，完全培养基中止消化，1 000 r/min离心5 min，再加入完全培养基重悬成细胞悬液，调整细胞浓度至1×107个/L，种入96孔板，200 μL/孔，在饱和湿度、37 ℃、5%CO2条件下培养24 h后，换液除去未贴壁的细胞。实验组分别加入浓度为0.25、0.5、1、1.5、3、6、12、25、50、100 mmol/L的含葛根素培养基各20 μL，然后加入含胎牛血清10%的培养基180 μL，对照孔不加药物，只加200 μL培养基作为空白对照，培养72 h，加入5 g/L的MTT 20 μL，37 ℃孵育4 h，吸去上清，每孔加入150 μL的二甲基亚砜，使用酶标仪检测570 nm吸光度(A)值。用统计学软件进行分析，最后取4个复孔的平均值，计算细胞破坏百分率，破坏率(%)={[A(细胞组)-A(给药组)]/[A(细胞组)-A(空白组)]}×100%。破坏率<5%的药物浓度视为无毒剂量。

1.2.3测定葛根素的最大有效浓度：将0.1%明胶加入6孔板中，轻轻摇匀使其完全覆盖各孔的底面，在超净工作台中静置30 min，用移液器吸除各孔的液体，晾干备用。将培养的第3代卵巢切除大鼠ADSCs悬液以1×105个/孔接种于6孔板，加入含10%胎牛血清的a-MEM培养基5 mL/孔，培养24 h后，设计葛根素实验组、阴性对照组及阳性对照组。根据所测定的无毒剂量结果，配制高、中、低3个浓度葛根素实验组。换液时，阴性对照组仅更换培养基，葛根素实验组更换含有不同浓度的葛根素培养基，阳性对照组更换为雌二醇1×10-4mmol/L培养基，3 d换液 1次。按上述设计共计5组，每组3孔，共15孔。

将ADSCs接种于上述同样方法处理的6孔板中，诱导培养至第7天后进行碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)染色。依次加入碱性磷酸酯酶染色缓冲液10 mL，BCIP溶液(300×) 33 μL，NBT溶液(150×) 66 μL，混匀后即配制成10.1 mL碱性磷酸酶染色工作液。移液器吸除6孔板中的培养基，PBS液轻柔冲洗3遍，加入1 mL碱性磷酸酶染色工作液，轻柔晃动，确保底部细胞能被染色液均匀覆盖。室温避光孵育1 h。吸除工作液，PBS液冲洗2遍，终止显色反应。最后显微镜下观察染色效果，拍摄记录。

将ADSCs接种于上述同样方法处理的6孔板中，诱导培养至第21天后进行茜素红染色。移液器吸除6孔板中的培养基，PBS液轻柔冲洗3次；加入2 mL/孔4%多聚甲醛溶液，固定30 min，吸除多聚甲醛溶液，PBS冲洗3遍；加入2 mL/孔茜素红染液，5 min后吸除茜素红染液，PBS冲洗3遍，显微镜下观察染色效果，并拍摄记录。

ALP活性检测：采用ALP底物试剂盒测定ALP的表达。在加入葛根素后5、7、10、12 d后的4个时间点进行检测。取一管显色底物，溶于2.5 mL的ALP反应缓冲液，充分溶解混匀，冰上放置。取出10 mmol/L的p-nitrophenol标准品溶液10 μL，加ALP反应缓冲液稀释至0.2 mL，得到最终浓度为0.5 mmol/L的标准品。取出待检测的96孔板，移液器吸除孔内的培养基，PBS清洗3遍，加细胞裂解液裂解细胞。将96孔板置于振荡仪上振荡90 s，37 ℃孵育20 min，加入100 μL反应终止液终止反应，再将96孔板振荡90 s后，用分光光度计在415 nm波长下计数并记录，分析各组结果。

2 结果

2.1 ADSCs鉴定(表1、图1)

表1 双侧卵巢切除大鼠第3代ADSCs(P3)与第21代细胞(P21)的表型抗原鉴定Table 1 Phenotypic antigen identification of the third generation ADSCs (P3) and the 21st generation cells (P21) in bilateral ovariectomy rats

图1 通过流式细胞技术对卵巢切除大鼠ADSCs的第3代和第21代进行表面抗体鉴定的对比分析Fig.1 Flow cytometry was used to identify the surface antibodies of the third and the 21st generation of ADSCs in ovariectomized rats

2.2 葛根素最大无毒剂量测定

使用含不同浓度葛根素的培养基诱导培养72 h，测得数据，发现葛根素抑制细胞增殖的作用随浓度升高而增强，12 mmol/L为无毒剂量的上限，细胞破坏率少于5%(图2)。

图2 无毒剂量测定Fig.2 Non-toxic dosimetry

2.3 最大有效浓度的测定结果

配制葛根素12 mmol/L高浓度组、1.5 mmol/L中浓度组、0.25 mmol/L低浓度组3组以及无葛根素的阴性对照组共4组培养液。4组培养7 d后进行碱性磷酸酶染色，可以观察到葛根素3组有明显蓝色，且差异显著，而阴性对照组无明显蓝色(图3)；4组培养21 d后进行茜素红染色，可以观察到葛根素组有明显红色矿化结节且差异显著，而阴性对照组无明显红色(图4)。

图3 碱性磷酸酶染色Fig.3 ALP staining

图4 茜素红染色Fig.4 Alizarin red staining

通过ALP活性测定，发现葛根素可以显著影响ALP活性，且与时间和剂量成正相关性，而阴性对照组ALP活性与时间无明显相关。在葛根素低浓度组和中浓度组中，ALP活性随时间的延长而增强；葛根素高浓度组ALP活性在前期随着时间的增加而增强，但在第12天和第10天无明显差异(图5)。

图5 细胞内碱性磷酸酶活性Fig.5 Intracellular alkaline phosphatase activity

上述结果表明，葛根素12 mmol/L为诱导绝经后SD大鼠脂肪干细胞成骨分化的最大有效无毒剂量。

3 讨论

雌激素治疗绝经后骨质疏松症的疗效已得到明确，但具有一定局限性。葛根素是植物类雌激素，与雌激素相似又不完全相同，具有抗绝经后骨质疏松作用，副作用又较雌激素低，可能是一种较好的抗骨质疏松药物[15]。本实验明确葛根素具有较强诱导脂肪干细胞向成骨分化作用，且与时间和浓度具有一定的正相关性。在SD大鼠体外实验显示，12 mmol/L为最佳浓度，为以后开发利用葛根素抗绝经后骨质疏松提供了理论依据。笔者前期实验发现，葛根素能抑制去卵巢大鼠骨量的丢失，有较好的骨代谢调节作用[9-10, 12-13]，对子宫等其他器官影响不明显[11]，对雌激素缺乏引起的骨质疏松症可能有一定的治疗作用，这与其他学者的研究结论一致。葛根素是20世纪50年代末从葛根中分离出来的主要生物活性成分，它可以在普通食品中获得，也可用于替代医学，对神经系统、心血管系统、骨质疏松、肝损伤、体内外炎症均有保护作用[16]。韩国学者通过高效液相色谱法分析，从野葛根或葛根藤提炼出来的异黄酮类有葛根素(7.5%)、大豆苷(4.2%)和染料木苷(1.9%)，主要成分为葛根素。他们的实验发现，骨质疏松模型(卵巢切除)组经过4周的葛根喂养，可明显增加股骨的骨密度，血浆17-雌二醇浓度会显著升高；与空白对照组相比，葛根喂养组没有改变胆固醇、高密度脂蛋白或低密度脂蛋白水平，但可明显降低甘油三酯水平，对肝脏、子宫和腹部脂肪组织的重量未受影响[17]。日本学者还发现，有C-糖苷的葛根素具有抵抗肠道消化的能力，可以被完整吸收利用，而染料木苷和大豆苷是有容易水解的O-糖苷；葛根素抗骨质疏松作用不是通过雌激素的受体途径，而大豆苷更像雌激素一样，是通过雌激素受体发挥作用的[18]。还有学者认为葛根素可预防骨质疏松症，其机制是对骨形成及NO/cGMP通路有促进作用，对诱导骨髓干细胞(hBMSC)增殖及成骨细胞分化有重要作用[19]。本实验虽然发现葛根素可以诱导脂肪干细胞向成骨分化，但具体机制及抗骨质疏松效果仍需进一步研究。