胃幽门螺杆菌感染与TLR4基因G11367C、NADPH氧化酶基因His72Tyr多态性的交互作用和特发性成年骨质疏松症的关系

张超贤 郭李柯 侯文根 秦咏梅

1.新乡医学院第一附属医院消化内科，河南 卫辉 453100 2.新乡医学院第一附属医院口腔科，河南 卫辉 453100 3.新乡医学院第一附属医院骨科，河南 卫辉 453100

特发性成年骨质疏松症(idiopathic osteoporosis in adult，IOIA)是一种发生在成年女性闭经前, 男性在 60 岁前而没有明显诱因的全身骨代谢疾病，表现为成年人骨量低下和骨的微细结构破坏、导致骨的脆性增加易发生骨折为特征的系统的全身性骨病，严重危害公众的健康[1]。IOIA病因和发病机制尚未完全明确，目前认为炎症反应、胰岛素抵抗和活性氧自由基损伤在IOIA发病中起重要作用，并与环境因素、遗传因素密切相关[2,3]。幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，H.pylori)作为消化系统最常见的感染细菌之一，其在慢性活动性胃炎消化性溃疡胃黏膜相关淋巴组织( MALT) 淋巴瘤和胃癌等中的致病作用已得到证实 近年研究还发现，H.pylori感染不仅与胃肠疾病相关，而且与一些胃肠以外的疾病也存在密切的相关性，可通过影响血脂代谢、胰岛素抵抗、炎症反应和氧化应激来参与IOIA的发生、发展[4]。Toll样受体4( toll-like receptor4，TLR4)TLR4是第一个被发现的Toll样受体，几乎存在于所有细胞表面，包括肝脏、脂肪组织、骨骼肌等，主要通过TLR4/核转录因子-κB(NF-κB)通路调控炎症因子的表达，继而调节胰岛素敏感性，影响胰岛素抵抗的发生。在基因突变或其他因素作用下，TLR4/NF-κB通路异常激活，导致炎症因子大量释放和胰岛素敏感性下降，促进IOIA的发生、进展[5]。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)氧化酶是机体产生活性氧自由基的关键酶，其活性变化将直接影响机体活性氧自由基水平，在IOIA的发生、发展中发挥重大作用[6]。TLR4、NADPH氧化酶基因具有多态性，即具有多个等位基因，不同的等位基因编码的TLR4或NADPH氧化酶活性有差异。TLR4或NADPH氧化酶基因的多态性可使机体对外界环境(如H.pylori感染)的反应能力有所不同，这是决定机体IOIA易感性的一个重要因素。TLR4、NADPH氧化酶基因多态性与IOIA易感性的研究日渐增多，但尚未见H.pylori感染与上述基因多态性的联合作用对IOIA易感性影响的报道。为了研究TLR4、NADPH氧化酶在当地人群中的分布状态，进而探索其和H.pylori感染相互作用与IOIA高发的关系，我们在国内首次开展了TLR4 和NADPH氧化酶联合基因多态性与IOIA易感性关系的研究。

1 材料与方法

1.1 一般资料

收集2011年5月～2015年7月在我院门诊和病房收治的IOIA确诊患者160例，无甲状腺、甲状旁腺、肾上腺病变者，不合并严重肝、胆、肾等疾病和类风湿性关节炎、 营养缺乏性疾病及其它引发骨质疏松疾病和因素，不合并免疫系统疾病，纳入研究时均为第一次就诊，未经任何药物和手术治疗，IOIA的诊断参照中华医学会骨质疏松和骨矿盐疾病分会2011年制定的原发性骨质疏松症诊治指南(2011年)[7]。对照组为160例同期健康体检者，两组按照年龄(±3)、性别、居住地进行1∶1配对，均为豫北居民或在豫北10年及以上，各组性别比(男∶女)均为97∶63例；IOIA组年龄19-50岁，平均(38.27±7.46)岁；对照组年龄18-49岁，平均(38.32±10.64)岁。两组在年龄、性别、民族和籍贯统计学处理差异无显著性，无血缘关系。采用统一的流行病学调查表，由经过专门培训的调查员对病例和对照组进行询问调查，收集研究对象的一般情况、 健康相关行为、 吸烟、饮酒、饮食习惯、 运动情况、 疾病史。饮食因素主要包括:饮食习惯、碳水化合物、蔬菜水果、肉类、蛋类、油脂、 家禽内脏、家畜内脏、煎炸食品等。饮食调查采用询问法，对主要膳食因素详细记录并折算成各种食物成分摄入量和产热量。饮食状况分为低脂饮食、高脂饮食(饮食中脂肪的产热量占总热量百分比超过25%持续1年以上定义为高脂饮食)，吸烟状况本文分为不吸烟者、吸烟者(将每天至少吸1支烟，持续半年以上定义为吸烟者)。饮酒定义为饮酒折合乙醇量男性大于140g/周(女性>70g/周)，持续半年以上。

1.2 H.pylori检测

14C-UBT试剂盒由深圳市中核海得威生物科技有限公司提供，所有待用试剂的配制均按试剂盒说明书进行。检测仪器为HUBT-01卡式幽门螺杆菌检测仪(深圳市中核海得威生物科技有限公司)。患者在清晨空腹时或至少禁食6 h以后受试，受试前漱口，口服14C-尿素胶囊一粒，嘱受试者整粒服下，20 ml温水送服，不得咬碎胶囊，3 min后再饮水20 ml，然后静坐15～20 min，等待采样。开启CO2吸收剂一瓶，倾入一洁净的液闪瓶内，嘱受试者通过吹气导管向CO2吸收剂徐徐吹气，不能倒吸入嘴内，力度适中，避免液体溅出，当CO2吸收剂的紫红色褪尽变为无色透明时，停止吹气。此时CO2吸收剂刚好吸收到所需的CO2采样量。向已采集呼气样品的液闪瓶内加入稀闪烁液4.5 ml，摇匀，测量样品每分钟衰变数(disntegration per minute, DPM)，以试剂盒提供的DPM≥100为阳性标准，本研究将H.Pylori感染状况分为未感染者(DPM<100)、100≤DPM<500感染者和DPM≥500感染者。

1.3 标本采集

每人各抽取静脉血2～3 ml，置乙二胺四乙酸钠抗凝管,分离白细胞层。用QIAampDNA提取试剂盒提取白细胞DNA，DNA置-30℃低温冰箱保存备用。

1.4 基因测定

1.4.1TLR4基因G11367C基因型检测[8]：采用单管双向等位基因特异性扩增技术对TLR4基因G11367C进行基因分型，引物序列为：外引物上游引物5′-：GTCATTCCAAAGTTATTGC CTACTAAG 3′，下游引物5′-GTGATATCTCATTGTGGTTTTTATTTTC-3′；内引物上游引物5′-：TAAACCCGGGGTGACC TCATGAAATCAG 3′，下游引物5′-TCTGAAAAAAA TAAACTTCTGCTGCTAG-3′。PCR反应体系包括：基因组DNA 1 μL，上下游引物各0.5 μL，Taq DNA聚合酶Mix液12.5 μL。反应条件为：95℃预变性5 min；95℃变性40 s，68℃退火1 min，72℃延伸40 s，20个循环，每个循环下降0.5℃，直到最适退火温度58℃，再进行95℃变性40 s，58℃退火40 s，72℃延伸40 s，共10个循环。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳，goldenview核酸染料染色，紫外透射凝胶成像系统确定可见3种带型: TLR4基因G11367C(GG)纯合子基因型个体显示为398和 599bp 两条DNA带，TLR4基因G11367C(GC)杂合子基因型个体显示257、398和599bp三条DNA带， 在各组中均未发现突变纯合子 CC基因型(图1)。每组随机抽取15个初步确定了基因型的样本，用PCR扩增后，送上海生工生物工程技术服务公司进行DNA序列测定进行验证，获得了100%的一致。

图1 TLR4基因G11367C PCR 产物检测Fig.1 The electrophoretogram of PCR product s of TLR4 gene G11367C.M: Marker; 1, 2: GG; 3, 4: GC

1.4.2NADPH氧化酶基因His72Tyr多态性分析[9]:引物序列为: 上游引物5′TGCTTGTGGGTA AACCAAGGCCGGTG3′，下游引物: 5′AACACTGAG GTAAGTGGGGGTGGCTCCTGT′，由上海生工生物技术有限公司合成。应用T aKaRa PCR Am-plification Kit( 大连宝生物工程有限公司) PCR 试剂盒在 25 μL PCR 反应体系中进行基因组 DNA 扩增, 0.5 μg DNA基因组DNA， 10×PCR Buffer2.5 μL，含M gCl21.5 μL(25 mol/ L)，2dNT P M ix ture 2 μL、TaKaRa Taq DN A 聚合酶0.125 μL ( 5 U /μL) , 引物各 1 μL (10 pmol/ L)，灭菌去离子水 17.375 μL。PCR反应条件如下：94 ℃ 4 min, 94 ℃变性30 s, 65℃ 3 min, 70 ℃ 1 min，33 个循环，最后 70 ℃延伸10 min。PCR 扩增后的基因片段为 348bp。取12 μL的 PCR 反应产物与限制性内切酶RsaⅠ(NEB公司)于37 ℃温浴过夜。酶切产物经 3.5% 琼脂糖凝胶电泳(含 0.5 μg/ ml 溴乙啶)进行分析，His72Tyr(HH)纯合子基因型个体显示 1条 348bp长的 DNA 片段, His72Tyr(TT)纯合子基因型个体显示188bp和160bp两条区带, His72Tyr(HT)杂合子基因型个体则显示348bp、188bp和160bp的3条区带(图1)。

对于上述PCR酶切法的结果，每组随机抽取了20个样本用PCR-单链构象多态性(PCR-single strand conformation polymorphism, PCR-SSCP)方法进行了验证, 扩增片段614bp，上游引物5′- TGGGGAA GTCGACTGCCT-3′，下游引物5′-：CAGTGCGTAGCAGTGGAATGAAC-3′，应用从65℃开始，每循环下降退火温度0.5℃，30个循环后在50℃退火温度上再进行15个循环。PCR产物用12%聚丙烯酰胺凝胶循环水冷35 W恒功率电泳5 h(Bio-Rad伯乐公司Mini-PROTEAN Tetra Cell电泳槽)，银染后与PCR酶切法的分型结果进行比对，获得了100%的一致。

图2 NADPH氧化酶基因His72TyrPCR 产物检测Fig.2 The electrophoretogram of PCR products of NADPH oxidase gene His72Tyr.M: Marker; 1, 2: HT; 3, 4: TT; 5, 6: HH

1.5 统计方法

Hardy-Weinberg平衡检验研究样本的群体代表性，以P>0.05为符合 Hardy-Weinberg规律。用比值比(OR)值和95%可信区间 (95% CI)评价相对风险，病例组和对照组之间的基因型频率和等位基因频率采用χ2检验检验，P<0.05为差异有统计学意义。非条件logistic回归模型分析交互作用。根据Khoury和Wagener提出的交互作用模型和交互系数(γ=βeg/βe)判断基因一环境交互作用模型以及交互作用类型[10]。判定依据1：γ>1，表示基因对环境暴露的效应有放大作用，正向交互作用；γ<1，表示基因对环境暴露的效应有减弱作用，负向交互作用；γ=1，表示基因对环境暴露没有交互作用。在病例对照研究中，γ为两变量lgOR的比值。判定依据2：OReg=ORe×ORg为相乘模型；OReg>ORe×ORg为超相乘模型；OReg

2 结果

2.1 IOIA组和对照组的一般资料分析

IOIA组和对照组性别、年龄分布差异无显著性意义(P>0.05)； IOIA组高脂饮食率、吸烟率和饮酒率均显著高于对照组(P<0.05)(表1)。

表1IOIA组和对照组的一般资料
Table1General information of IOIA and control group

指标对照组Control groupIOIA组IOIA groupP性别(Gender) [ n(%) ]0.2143 男(Male) 97(60 .63%) 97(60 .63%) 女(Female)63(39 37%)63(39 37%) 年龄(岁)[Age( year)] 38.27±7.4638.32±10.640.2835饮食习惯(Diet status) 0.0068 低脂饮食(Low-fat diet)129(80.63%) 84(52.50%) 高脂饮食(High-fat diet) 31(18.37%) 76(47.50%)饮酒状况(Drinking status)0.0075 不饮酒(No)125(78.13%)86(53.75%) 饮酒(Yes)35(21.87%)74(46.25%)吸烟状况(Smoking status)0.0212 不吸烟(No)105(65.63%)83(51.88%) 吸烟(Yes)55(34.37%)77(48.12%)

2.2 IOIA易感性与 H.pylori感染的相关性分析

100≤DPM<500和DPM≥500H.pylori 感染者频率分布在在IOIA组分别为28.75%和40.63%，在对照组分别为15.63%和11.87%，上述H.pylori 感染状况频率在IOIA组与对照组之间均有显著差异(P均<0.01)。100≤DPM<500和DPM≥500H.pylori 感染者患IOIA的风险性均明显增高(OR=4.4463，OR=8.0238)，而DPM≥500H.pylori 感染者患LSCC的风险性则又明显高于100≤DPM<500H.pylori 感染者( P<0.01)(表2)。

表2 IOIA易感性与 H.pylori感染的相关性分析Table 2 Correlation analysis between IOIA susceptibility and H.pylori infection

a: 按照性别、年龄、饮食习惯、饮酒和吸烟状况调整；与100≤DPM<500相比，*P<0.01
a:adjusted according to gender, age, diet status, drinking status and smoking status*P<0.01vs100≤DPM<500

2.3 TLR4基因G11367C和NADPH氧化酶基因-C242T基因型和等位基因频率关联分析

经Hardy-Weinberg 平衡检验，TLR4基因G11367C各基因型在对照组中的分布均符合Hardy-Weinberg 规律(P>0.05)，说明研究群体具有代表性(见表3)。GG和GC基因型频率在病例组和对照组差异有显著性(P<0.01)；等位基因C在IOIA组和对照组之间的分布差异具有统计学意义(P<0.01)，且OR值大于1，说明含等位基因C的个体发生IOIA的风险相对较高；两位点的不同基因型在病例、对照组之间的分布差异均具有统计学意义(P< 0.01)。结果表明：TLR4基因G11367C(G→C突变)可能增加IOIA的患病风险(表2)。NADPH氧化酶基因His72Tyr 3种基因型、等位基因频率亦符合上述规律(表4)。

表3TLR4基因G11367C基因型与等位基因分布
Table3Distribution of polymorphisms of TLR4 gene G11367C genotypes and alleles

指标IOIA组IOIA group对照组Control groupORa95% CIP基因型 (Genotype) GG47(29.38%)115 (71.88%)1. 00 GC113(70.62%)45(28.12%)6.14423. 4725-9.80360.0073等位基因 (Allele) G207(64.69%)275(85.94%)1. 00 C113(35.31%)45 (14.06%)3.33601. 8790-7.97870.0086

a: 按照性别、年龄、饮食习惯、饮酒、吸烟状况和H.Pylori感染状况调整
a:adjusted according to gender, age, diet status, drinking status , smoking status and H.pylori infection status

表4 NADPH氧化酶基因His72Tyr与等位基因分布Table 4 Distribution of NADPH oxidase gene His72Tyr polymorphism genotypes and alleles

a: 按照性别、年龄、饮食习惯、饮酒、吸烟状况和H.Pylori感染状况调整
a:adjusted according to gender, age, diet status, drinking status , smoking status and H.pylori infection status

2.4 IOIA危险因素的多因素非条件Logistic回归

为进一步分析IOIA的危险因素，将H.pylori感染状况、G11367C和His72Tyr基因型作为自变量，以是否发生IOIA作为因变量Y(0：未患IOIA；1：患IOIA)，采用逐步后退法进行非条件Logistic回归，主要变量赋值见表5。结果显示，H.pylori感染、 G11367C和His72Tyr与IOIA发生有统计学关联，见表6。

表5 非条件Logistic回归分析变量赋值表Table 6 The variables in non-conditional logistic regression analysis

表6 IOIA危险因素的非条件Logistic回归分析Table 6 The results of the non-conditional logistic regression analysis on the risk factors of IOIA

2.5 TLR4基因G11367C和NADPH氧化酶基因His72Tyr多态性在IOIA发病中的交互作用

基因突变的协同分析发现G11367C(GC)/His72Tyr (TT)基因型者频率在IOIA组和对照组的分布频率分别为25.63%和3.75%，此基因型频率经χ2检验在两组之间有显著性差异(P<0.01)。G11367C(GC)/His72Tyr(TT)基因型者患IOIA的风险显著增加(OR=39.5731)，G11367C(GC)和His72Tyr(TT)基因型在IOIA发生、发展存在正向的交互作用 (γ2=β2*3/β3，γ3=β2*3/β2；γ2=2.0887，γ3=1.9856)，另外G11367C(GC)和His72Tyr(HT)之间也存在正向交互作用(γ>1) (表7)。

2.6 H.pylori感染和TLR4基因G11367C和NADPH氧化酶基因His72Tyr多态性在IOIA发病中的交互作用

单纯100≤DPM<500的H.pylori感染的ORe1为4.4111，单独携带G11367C(GC)型的ORg为6.2879，两者同时存在时，交互作用ORe1g为27.1020，交互系数γ=βe1g/βe=>1，ORe1g>ORe1×ORg为超相乘模型；另外数据分析显示在DPM≥500和-C34G (CG) 之间也存在正向交互作用(γ=βe1g/βe=>1)(表8)。同样在100≤DPM<500 和His72Tyr(HT)之间、100≤DPM<500 和 His72Tyr (TT)之间、DPM≥500 和His72Tyr(HT)之间及DPM≥500和His72Tyr(TT)在IOIA发生、发展中也存在正向交互作用(γ均大于1)(表9)。

表7 TLR4基因G11367C和NADPH氧化酶基因His72Tyr多态性在IOIA发病中的交互作用Table 7 Interaction of polymorphisms between TLR4 gene G11367C and NADPH oxidase gene His72Tyr in IOIA.

a: 按照性别、年龄、饮食习惯、饮酒、吸烟状况和H.Pylori感染状况调整;b: 单纯His72Tyr杂合突变型暴露的OR值(OR1)；c: 单纯His72Tyr纯合突变型暴露的OR值( (OR2)；d: 单纯G11367C杂合突变型暴露的OR值(OR3)；e: G11367C 杂合突变型和His72Tyr杂合突变型交互后的OR值 (OR1*3)；f: G11367C 杂合突变型和His72Tyr纯合突变型交互后的OR值 (OR2*3)
a:adjusted according to gender, age, diet status, drinking status and smoking status;b: OR value by simple His72Tyr heterozygote exposure (OR1)；c: OR value by simple His72Tyr homozygous mutant exposure (OR2)；d: OR value by simple G11367C heterozygote exposure(OR3)；e: OR value by the interaction of G11367C heterozygote and His72Tyr heterozygote (OR1*3)；f: OR value by the interaction of His72Tyr homozygous mutant and G11367C heterozygote (OR2*3)

表8 H.pylori感染和TLR4基因G11367C多态性在IOIA发病中的交互作用Table 8 Interaction between H.pylori infection and TLR4 gene G11367C polymorphism in IOIA

a: 按照性别、年龄、饮食习惯、饮酒和吸烟状况调整；b: 单纯100≤DPM<500 H.pylori感染暴露的OR值(ORe1)；c: 单纯DPM≥500 H.pylori感染暴露的OR值(ORe2)；d: 单纯杂合突变型暴露的OR值 (ORg)；e: 100≤DPM<500 H.pylori感染与杂合突变型交互后的OR值 (ORe1g)；f: DPM≥500 H.pylori感染与杂合突变型交互后的OR值(ORe2g)
a:adjusted according to gender, age, diet status, drinking status and smoking status;b: OR value by simple 100≤DPM<500 exposure (ORe1)；c: OR value by simple DPM≥500 exposure (ORe2)；d: OR value by simple heterozygote type exposure (ORg)；e: OR value by the interaction of 100≤DPM<500 and heterozygote (ORe1g)；f: OR value by the interaction of DPM≥500 and heterozygote (ORe2g)

表9 两组 H.pylori感染和NADPH氧化酶基因His72Tyr多态性在IOIA发病中的交互作用Table 9 Interaction between H.pylori infection and NADPH oxidase gene His72Tyr polymorphism in IOIA

a: 按照性别、年龄、饮食习惯、饮酒和吸烟状况调整；b: 单纯100≤DPM<500 H.pylori感染暴露的OR值(ORe1)；c: 单纯DPM≥500 H.pylori感染暴露的OR值(ORe2)；d: 单纯杂合突变型暴露的OR值 (ORg1)；e: 100≤DPM<500 H.pylori感染与杂合突变型交互后的OR值 (ORe1g1)；f: DPM≥500 H.pylori感染与杂合突变型交互后的OR值(ORe2g1)；g: 单纯纯合突变型暴露的OR值e (ORg2)；h: 100≤DPM<500 H.pylori感染与纯合突变型交互后的OR值 (ORe1g2)；i: DPM≥500 H.pylori感染与纯合突变型交互后的OR值(ORe2g2)
a:adjusted according to gender, age, diet status, drinking status and smoking status;b: OR value by simple 100≤DPM<500 exposure (ORe1)；c: OR value by simple DPM≥500 exposure (ORe2)；d: OR value by simple heterozygote type exposure (ORg1)；e: OR value by the interaction of 100≤DPM<500 and heterozygote (ORe1g1)；f: OR value by the interaction of DPM≥500 and heterozygote (ORe2g1)；g: OR value by simple homozygous mutant type exposure (ORg2)；h: OR value by the interaction of 100≤DPM<500 and homozygous mutant (ORe1g2)；i: OR value by the interaction of DPM≥500 and homozygous mutant (ORe2g2)

3 讨论

TLR4在自然配体LPS作用下导致NF-κB激活从而释放肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β( IL-1β)等大量炎症因子，这些细胞因子可调控骨的吸收或转化，在破骨细胞生成的早期，能诱导骨组织中破骨细胞活化因子的表达，刺激较原始的破骨细胞前体分裂和增殖， 促进破骨细胞形成及骨吸收，从而导致局部或全身的骨质疏松。另外上述的TNF-α、 IL-1β等各种炎症因子大量分泌入血，进而发生全身性低度慢性炎症反应，最终使机体发生了胰岛素抵抗，胰岛素抵抗通过影响肾1a-羟化酶的活性，影响肾对钙磷的调节， 以及继发甲状旁腺激素等激素分泌异常从而干扰骨代谢，胰岛素敏感性降低还引起蛋白质代谢障碍，蛋白质分解增加，合成受抑制，而蛋白质是构成骨架的基本物质，其减少可导致骨质减少，使钙、 磷不能在骨骼中沉积，造成骨质疏松[11]。人类TLR4基因定位于9q329q33，目前研究较多的是Asp299Gly 和Thr399Ile变异，但这两个多态位点在中国人群中非常罕见。研究发现在中国正常人群中发现TLR4基因3′未翻译区(3′UTR)11367位点的多态性，此突变属于功能性变异，可改变血液和组织中TLR4的表达，影响其生物学效应。TLR4基因3′未翻译区11367多态性具有三种基因型: 野生型纯合子G11367C(GG)、杂合子G11367C(GC)和突变纯合子G11367C(CC)，国内外已有研究报道认为G11367C位点的多种炎性疾病有关[12-13]。本研究各组未发现突变纯合子G11367C(CC)基因型，发现杂合子G11367C(GC)基因型与IOIA发生、发展有关，与对照组比较差异有统计学显著性，携带G11367C(GC)基因型者患IOIA的风险高于携带G11367C(GG)的个体(OR=6.1442，95% CI 3.4725-9.8036，P<0.01)，与G11367C位点变异增加炎症相关性疾病发病风险的结论一致。G11367C(GC)基因型基因型者易患IOIA的机理还不清楚，相关研究显示C等位基因可能通过活化TLR4基因转录过程，增加TLR4表达，促进炎症因子的释放，降低胰岛素敏感性[14]，从而增加IOIA发生的危险性。

人体过多的活性氧簇( reactive oxygen species, ROS)能抑制成骨家属谱系细胞的增殖分化，导致成骨家属谱系细胞的死亡，促进破骨细胞形成和分化，在骨质疏松的发生过程中起重要作用[15,16]。氧化应激机制中，NADPH氧化酶是生成活性氧簇的主要来源，其主要亚基中质膜结合成分p22phox为跨膜亚基，是NADPH氧化酶酶促的核心作用部分，p22phox亚基的多态性影响NADPH氧化酶的功能。位于16号染色体4号外显子上的第242密码子存在C→T基因突变, 使得编码的72号氨基酸由组氨酸变为酪氨酸。72号组氨酸残基是p22phox结合血红素的部位，由于基因的改变使p22phox结合血红素的能力下降,从而影响了NADPH氧化酶的活性[17]。研究证明NADPH氧化酶p22phox亚基基因His72Tyr多态性可增加氧化应激相关疾病如冠心病、脑血管疾病等的的发病率[18,19]。本研究发现His72Tyr (HT)和His72Tyr(TT)基因型与IOIA的发生有关，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)，携带His72Tyr (HT)和His72Tyr(TT)基因型者患IOIA的风险高于携带His72Tyr(HH)的个体(OR=6.7773，95% CI 3.4192-10.2130，P<0.01；OR=6.4737，95% CI 3.1795-10.2159，P<0.01)，与相关研究结果一致。

IOIA是涉及环境因子和多种基因相互作用的复杂过程，本研究提示TLR4基因G11367C杂合突变型与NADPH氧化酶基因His72Tyr突变基因型的个体属 IOIA高危险人群, IOIA诊治方案中应加以重视。虽然尚不能通过改变其 IOIA易感的基因型来防治 IOIA，但可以通过TLR4基因G11367C与NADPH氧化酶基因His72Tyr基因检测，预测个体发生 IOIA的风险性，采取相应的控制环境病因的措施如根除H.Pylori或调控基因表达以达到有效预防 IOIA的目的。另外通过基因预测个体成年后发生 IOIA的风险性，为预测运动员的发展前途、早期选拔运动员提供参考。