红车轴草总异黄酮含药血清对MC3T3-E1细胞增殖、分化和矿化的影响

余 倩 宋双红,2 李翠芹*

1.西北濒危药材资源开发国家工程实验室/药用资源与天然药物化学教育部重点实验室/陕西师范大学生命科学学院，陕西 西安 710119 2.西北工业大学生命学院特殊环境生物物理学研究所，空间生物实验模拟技术重点实验室，陕西 西安710072

红车轴草(TrifoliumpratenseL.)是一种多年生草本植物，属于豆科车轴草属，又名红三叶草，其花序和花枝含有大量异黄酮成分，因其具有雌激素样作用而备受关注[1]。研究表明红车轴草总异黄酮具有改善妇女更年期症状和防治疗骨质疏松的作用[1-3]。本研究采用血清药理学和体外培养MC3T3-E1成骨样细胞的方法观察含红车轴草总异黄酮的大鼠血清对MC3T3-E1成骨样细胞增殖、分化及矿化的影响，从细胞学水平探讨红车轴草总异黄酮促进骨形成的作用机制，为红车轴草总异黄酮治疗骨质疏松症的研究提供一定的资料。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1动物与细胞系：健康SD雌性大鼠32只，体重200±20 g，购自第四军医大学SPF动物实验中心，动物合格证号陕医动字08-014号。饲养条件：室温24±2 ℃，相对湿度40%～70%，每日人工照明和黑暗处理各12 h，自由饮水，喂食颗粒饲料。MC3T3-E1成骨样细胞系(中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心)。

1.1.2药物和试剂：红车轴草总异黄酮(陕西慈缘生物技术有限公司，含量≥98.0%，批号为CY140415)；α-MEM培养基和胎牛血清(FBS)(Gibco公司)；维生素C、β-甘油磷酸钠、噻唑兰(MTT)和胰蛋白酶(Sigma公司)；碱性磷酸酶试剂盒(南京建成生物工程研究所)；骨钙素(OC)测试盒(北京科盈美科技有限公司)；茜素红(天津化学试剂厂)；链霉素、青霉素(华北制药厂)；二甲亚砜(DMSO)(MP Biomedicals公司)，其余试剂均为分析纯级。

1.1.3仪器：恒温CO2培养箱(新加坡艺思高科技有限公司)，Infinite M200型多功能酶标仪(奥地利Tecan公司)，倒置显微镜(日本Olympus公司)，YJ-875型超净工作台(苏州净化设备厂)，离心机(江苏牡丹离心机制造有限公司)，超低温冰箱。

1.2 方法

1.2.1含药血清的制备：32只雌性SD大鼠，随机分成2组，一组为服药组，按100 mg/kg灌服红车轴草总异黄酮，每天1次，连续7 d。另一组为对照组，只灌服相同体积的生理盐水。第7 d灌胃1.5 h后，所有大鼠均在乙醚麻醉下自腹主动脉抽取血液，同组合并后于4℃静置30 min，以2000×g、4℃离心20 min获取红车轴草总异黄酮含药血清或对照血清(生理盐水含药血清)。血清在56℃灭活30 min， 0.22 μm 滤膜过滤除菌后，-80℃保存备用，使用时注意避免反复冻融。

1.2.2细胞培养：MC3T3-E1细胞复苏后接种于细胞培养瓶中，以含10% FBS、1%配制好的双抗的α-MEM培养基培养，2 d换液1次，待细胞铺满80%瓶底后胰蛋白酶消化传代，继续培养，待细胞再次铺满80%瓶底后胰蛋白酶消化，以不同的密度接种于96孔板或者24孔板进行实验。

1.2.3细胞增殖测定：培养中的细胞铺满80%～90%瓶底后胰蛋白酶消化传代，以2×103个/孔的密度接种于96孔板中，每孔总体积200 μL。24 h后加入含不同浓度红车轴草总异黄酮含药血清的培养液，终浓度分别为2.5%、5%和10%，对照组加入含大鼠空白血清的培养液，终浓度分别为2.5%、5%和10%，调零组不含细胞和药物，每组设置6个平行孔。24 h、48 h、72 h和96 h后向培养液中加入20 μL的MTT，继续培养4 h。弃培养液，每孔加入100 μL的DMSO，振荡10 min以保证甲瓒全部溶解，酶标仪570 nm处测定光光密度D(λ)值，计算细胞增殖率。

1.2.4碱性磷酸酶活性测定：培养中的细胞铺满80%～90%瓶底后胰蛋白酶消化传代，以5×103/孔的密度接种于96孔板中，每孔总体积200 μL。待细胞铺满孔底后更换为含有维生素C和β-甘油磷酸钠的诱导性培养基，实验组加入不同浓度的红车轴草总异黄酮含药血清，终浓度分别为2.5%、5%和10%，对照组加入含大鼠空白血清的培养液，终浓度分别为2.5%、5%和10%，调零组不含细胞和药物，每组设置6个平行孔。每2 d换对应的诱导性培养液，在第3 d和第6 d按照试剂盒说明书测定碱性磷酸酶的活性。

1.2.5骨钙素含量的测定：培养中的细胞铺满80%～90%瓶底后胰蛋白酶消化传代，以5×104/孔的密度接种于24孔板中，每孔总体积1 mL。待细胞铺满孔底后更换为含有维生素C和β-甘油磷酸钠的诱导性培养基，实验组加入5%红车轴草总异黄酮含药血清，对照组加入5%空白大鼠血清，调零组不含细胞和药物，每组设置3个平行孔。细胞诱导性培养后每3 d换1次培养液，每次换液保留1 mL旧培养液，于-20℃保存，连续收集第3 d、6 d、9 d、12 d 的样品，采用ELISA法检测骨钙素的分泌量，以mg/L培养液表示。

1.2.6细胞矿化结节量测定：培养中的细胞铺满80%～90%瓶底后胰蛋白酶消化传代，以5×104/孔的密度接种于24孔板中，每孔总体积1 mL。待细胞铺满孔底后更换为含有维生素C和β-甘油磷酸钠的诱导性培养基，实验组加入5%红车轴草总异黄酮含药血清，对照组加入5%空白大鼠血清，调零组不含细胞和药物，每组设置3个平行孔。每2 d换对应的诱导性培养液，在第6 d、12 d、18 d弃去培养液，PBS清洗3次后用70%的乙醇固定1 h，蒸馏水清洗3次，加入提前配制的40 mmol/L茜素红染液(pH=4.2)于37℃孵育10 min，再用蒸馏水清洗3次，用PBS于37℃孵育10 min，镜下观察矿化结节并量化。

2 结果

2.1 红车轴草总异黄酮含药血清对MC3T3-E1细胞增殖的影响

MTT实验结果(图1)表明：红车轴草总异黄酮含药血清各浓度组与对照组相比，作用于细胞48 h、72 h和96 h，均可显著提高MC3T3-E1成骨样细胞的增殖率。

图1 细胞增殖率检测，与空白组比较(*P<0.05 vs control.)C: 对照组; L: 低浓度组(2.5%); M: 中浓度组(5%); H: 高浓度组(10%);Fig.1 Cell proliferation rate defection.compared with the controlC: control; L: low concentration group (2.5%); M: middle concentration group (5%); H: high concentration group (10%).

2.2 红车轴草总异黄酮含药血清对MC3T3-E1细胞分化的影响

碱性磷酸酶(ALP)活性测定实验结果(图2)表明：与对照组相比，5%红车轴草总异黄酮含药血清作用于MC3T3-E1细胞3 d、6 d、9 d和12 d、均能显著提高其碱性磷酸酶的活性。

图2 相对ALP活性检测，与空白组比较(*P<0.05 vs control.)C: 对照组; L: 低浓度组(2.5%); M: 中浓度组(5%); H: 高浓度组(10%)Fig.2 Detection of relative ALP activity.Compared with the control,(*p<0.05 vs control.).C: control; L: low concentration group (2.5%); M: middle concentration group (5%); H: high concentration group (10%)

2.3 红车轴草总异黄酮含药血清对MC3T3-E1细胞骨钙素分泌的影响

ELISA法检测骨钙素的分泌量(图3)表明：5%的红车轴草总异黄酮含药血清处理MC3T3-E1细胞6 d和9 d骨钙素分泌量显著高于对照组。

图3 骨钙素分泌检测，与空白组比较(*P<0.05,**P<0.01 vs control.)C：大鼠空白血清对照组；TLES：红车轴草总异黄酮含药血清组Fig.3 Detection of osteocalcin level.Compared with the control,*P<0.05,**P<0.01 vs controlC: blank rat serum control group; TLES: serum containing the total isoflavones from t.Pratense group

2.4 红车轴草总异黄酮含药血清对MC3T3-E1细胞矿化的影响

茜素红染色法测定结果(图4)表明：5%红车轴草总异黄酮含药血清处理细胞6 d、12 d和18 d，形成的矿化结节数均显著高于对照组。

图4 A：第18 d显微镜下观察的矿化结节(a：对照组4×；b：红车轴草总异黄酮含药血清组4×)；B：矿化结节面积的量化分析(*P<0.05 vs control.)C：大鼠空白血清对照组；TLES：红车轴草总异黄酮含药血清组Fig.4 Detection of relative mineralization.A: Images of mineralized nodules observed in microscope on D18.(a: control, 4×; b: serum, 4×).B: Quantitative analysis of the area of mineralization,*p<0.05 vs control.C: Blank rat serum group; TLES: serum containing the total isoflavones from t.Pratense group.

3 讨论

骨重建是健康骨组织中的一个重要生理过程，其主要包括成骨细胞的骨生成过程和破骨细胞的骨吸收过程，若骨吸收过程大于骨生成，则就会形成骨质疏松症等疾病[4]，骨质疏松症是全球四大非传染性致死疾病之一，直接导致患病人群的生活质量下降和一定的经济负担[5]。因此，筛选抗骨质疏松症药物并在细胞学水平进行药效评价是非常必要的。

机体是一个复杂的系统，骨代谢受多种因素的影响，药物在体内代谢可产生许多药理活性产物，出现许多药理作用。红车轴草总异黄酮主要包括大豆苷元(daidzein)、染料木素(genistein)、鹰嘴豆芽素A(biochanin A)和鹰嘴豆芽素B(biochanin B)等。异黄酮类成分在肝脏与葡糖醛酸、硫酸结合后部分以原形排出体外。先前研究提示大豆苷元仅口服剂量的7%-30%从尿中排出和小于10%从粪便排出[6-7]，表明大豆苷元在体内进行广泛代谢，除部分转化牛尿酚(equol)和O-去甲基安哥拉紫檀素(O-desmethylangolensin)外，大豆苷元在肝微粒体中可发生羟化代谢，其中单羟基化代谢物为其主要代谢物[8-9]。另外，细菌也氧化部分异黄酮。因此，通过中药血清药理学的方法进行研究有着更重要的意义。

成骨细胞起源于多能的骨髓基质的间质细胞，在骨形成过程中经历分裂增殖、分化成熟和基质钙化3个阶段。MC3T3-E1细胞是从C57BL/6小鼠颅顶骨细胞中建立的成骨细胞株，国际上常作为骨代谢研究的细胞模型，在细胞水平上阐明药物防治骨质疏松症的作用机制。本实验应用红车轴草总异黄酮含药血清在细胞水平上以MC3T3-E1成骨细胞的增殖、碱性磷酸酶活性、骨钙素生成以及矿化结节形成为指标，观察其对体外培养的MC3T3-E1成骨样细胞的影响。结果显示：不同浓度的红车轴草总异黄酮含药血清作用于细胞48 h、72 h和96 h，均可显著提高MC3T3-E1成骨样细胞的增殖率(P<0.05)，并具有一定的时效关系，说明其具有促进MC3T3-E1成骨样细胞增殖的作用。

碱性磷酸酶和骨钙素分别是成骨样细胞早期和晚期分化的标志，是最常见评价骨形成的指标，与对照组相比，红车轴草总异黄酮含药血清各浓度组在作用6 d、9 d和12 d均能显著提高碱性磷酸酶的活性(P<0.05)；而且，5%红车轴草总异黄酮含药血清可显著性促进成骨样细胞的骨钙素分泌，提示其能促进成骨细胞分化。

骨基质的矿化对于骨量的增加是至关重要的。它不仅是成骨细胞的重要生物学特征，也是考察药物对成骨细胞促成骨作用的最有效方式。5%红车轴草总异黄酮含药血清处理细胞6 d、12 d和18 d形成矿化结节数都显著高于对照组，提示其能促进成骨细胞矿化。

本实验从红车轴草总异黄酮含药血清对MC3T3-E1成骨样细胞的增殖、碱性磷酸酶活性、骨钙素以及矿化等四方面进行了研究，结果显示红车轴草总异黄酮含药血清不仅可以增加MC3T3-E1成骨样细胞的增殖率，提升碱性磷酸酶的活性，还可以促进MC3T3-E1成骨样细胞的骨钙素分泌，进而提高成骨样细胞的矿化水平。

综上所述，本实验在细胞水平观察了红车轴草总异黄酮含药血清对MC3T3-E1成骨样细胞代谢调控的影响，发现其具有促进MC3T3-E1成骨样细胞增殖、促进细胞分化成熟、以及促进细胞矿化的作用，从而为红车轴草总异黄酮应用于临床治疗骨质疏松症提供了理论和实验依据。