1型糖尿病骨质疏松大鼠模型的建立及评价

张丽媛 纳青青 吴天秀 周满如 李近 刘钰瑜

1.广东医学院解剖学教研室，湛江 524023 2.广东医学院药理学教研室，湛江 524023

糖尿病与冠心病、肿瘤是当前影响人类健康的三大非传染性疾病，已成为全球性的卫生问题。根据WHO的预测报告，到2030年时，全球会有4.39亿人患有糖尿病，约占世界总人口的7.7%[1]。依赖胰岛素的1型糖尿病是由免疫炎性T细胞通过直接或间接的方式选择性损毁胰岛β细胞导致的慢性自身免疫性疾病，多发于青少年。

早在1948年，Albright首先报道了血糖长期控制不良的糖尿病病人可以发生骨质疏松症。目前的研究已经明确1型糖尿病能够导致骨量减少，使骨折危险性增加，但还不清楚其导致骨量减少的进程，其作用机制也存在争议[2]。目前大多数研究是针对中老年女性发生骨质疏松进行研究，较少研究青少年糖尿病性骨质疏松，且对该疾病的研究大多局限在某一选定时间点上，没有对整个疾病进程的变化情况进行系统的研究分析。为了进一步研究1型糖尿病大鼠骨质疏松症的发病机理和药物对其的防治作用，我们迫切需要一个动物模型进行研究，所以，建立理想的动物模型至关重要。

1 材料与方法

1.1实验材料与仪器

炭化钨钢刀(德国 LEICA 公司); LEICA2155 硬组织切片机 (德国 LEICA 公司); 低速锯 (BuehlerLTD． USA); 数字化板(SummaSketchRIiplus); LEICAMP30 荧光显微镜及显微照相机 (德国 LEICA 公司); LEICA QWN 半自动图象分析仪(德国 LEICA公司);Micro-CT(SKYSCAN 1176)； AE240 电子天平(梅特勒-托利多仪器公司上海分公司); 游标卡尺(湛江市量具刃具厂); 电热恒温电烤箱(上海跃进医疗器械厂); IRIS/AP 电感偶合等离子体发射光谱仪(TJA，USA)。

1.2实验动物与方法

SD大鼠60只，雄性，体质量(201±20) g，3 月龄，由广东省医学实验动物中心提供(动物合格证书编号: 2006A015)。将60只大鼠随机分为模型组、对照组，每组30只。

1.3造模与处理

1型糖尿病大鼠模型制备：分别用常规饲料喂养1周，第1周末禁食12 h后，进行腹腔注射STZ60 mg/kg[3]，注射部位选择在下腹部后1/3处避开中部膀胱。造模72 h后，以血糖≥17.6 mmol/L作为成模标准，其余未成模大鼠剔除实验。两组大鼠均正常饲养，保持合适的温度和湿度，给予充足的饮水和食物，定期监测血糖，保证模型的稳定。实验过程中通过活体MicroCT分析及三维结构重建，测得实验组大鼠的骨密度值。采用随机数字表法，分别于造模成功后1周、4周、8周、12周、16周各随机选取6只糖尿病模型大鼠和周龄相匹配的6只对照组大鼠处死。选取大鼠称重后，分别以1%的氯胺酮100 mg/kg腹腔注射行全身麻醉，留取所处死大鼠的股骨以备下一步实验用。

1.4观察指标

骨标本的制作及测量指标: 实验结束后，用 3% 戊巴比妥钠(1.5 mL/kg) 行腹腔注射麻醉后右心室彻底抽血处死(以减少骨髓中红细胞，排除干扰，使骨片更易于观察分析)。取大鼠左侧股骨，剔干净软组织。左侧胫骨用低速据沿额状面锯开干骺端，暴露骨髓腔，于胫骨上端 1 /3 处横行锯断胫骨，此为胫骨上端。将余下的胫骨于胫骨和腓骨结合处横向锯开，作中段骨检测。用 LEICA QWN 半自动图象分析仪测定并根据公式计算骨小梁面积、骨小梁厚度、骨小梁数目及骨小梁分离度[4]。

2 统计学处理

数据均采用SPSS18.0统计软件进行处理，结果以“均数±标准差”表示，组内两样本均数比较采用独立样本的t检验，组间差异采用单因素方差分析的方法分析。

3 实验结果

3.1造模后大鼠空腹血糖的变化情况 造模前对照组和造模组血糖无差异。造模后，模型组血糖远远高于正常组，并且在实验进行期间，造模组的血糖一直维持在高位，说明本实验造模成功。

表1 两组大鼠不同时间血糖变化(mmol/l)Table 1 The change of blood glucose in rats of two groups (mmol/L)

注：与对照组相比，*P<0.05，ΔP<0.01
Compared to controls,*P<0.05,ΔP<0.01

3.2造模对大鼠体重变化的影响

对照组大鼠体重从第1周至第16周一直呈上升趋势，，模型组大鼠的体重在各选定实践点都低于对照组，但第1周差异无统计学意义，在第4周后模型组大鼠体重明显低于对照组，且差异有统计学意义(P<0.05)。同时观察造模大鼠的一般情况，发现造模后大鼠明显多饮多尿，结合大鼠体重变化，可以从症状上判定造模成功，见表2。

表2 两组大鼠不同时间体重变化(g)Table 2 The change of body weight in rats of two groups (g).

注：与对照组相比，*P<0.05，ΔP<0.01
Compared to controls,*P<0.05,ΔP<0.01

3.3造模对大鼠股骨骨密度的影响

随着大鼠年龄的增长，正常大鼠股骨骨密度无明显变化，糖尿病大鼠股骨骨密度逐渐降低。与对照组相应时间点比较，模型组大鼠股骨骨密度明显降低(P<0.05或P<0.01)，见表3。

表3 两组大鼠不同时间股骨骨密度变化(g/cm3)Table 3 The change of BMD of the femur in rats of two groups (g/cm3).

注：与对照组相比，*P<0.05，ΔP<0.01
Compared to controls,*P<0.05,ΔP<0.01

3.4造模对大鼠形态计量学参数的影响

表4 两组大鼠不同时间胫骨上端形态计量学参数比较Table 4 Comparison of histomorphometry parameters of the upper tibia between the two groups.

注：与对照组相比，*P<0.05，ΔP<0.01
Compared to controls,*P<0.05,ΔP<0.01

由表4可见，骨小梁面积于第1W即开始降低，此后持续降低，第4W降低达17.71%；于第4W-第8W间降低速度最快，幅度最大，达到48.09%。骨小梁厚度也是第1W即开始降低，此后持续降低，第4W降低达11.49%；于第4W-第8W间降低速度最快，幅度最大，达到48.91%。骨小梁数目降低较缓和，各个时间段下降的幅度差别不大。骨小梁分离度与第1W即开始增加，此后持续增加，第4W增加达13.17%；于第4W-第8W间增加速度最快，幅度最大，达到51.28%。

4 讨论

近年来糖尿病患病人数激增，已经受到越来越多人的重视，逐渐成为研究的热点。现已明确I型糖尿病能够导致骨量减少，骨折危险性增加，但是糖尿病性骨质疏松的发病机理还未得到最终阐明[5]，在糖尿病研究领域寻找比较接近人类糖尿病发病过程的动物模型，对于更深入阐明糖尿病性骨质疏松的发病机理及分子生物学机制具有重要的科学意义。

糖尿病模型制备的选择：糖尿病动物模型有实验性和自发性动物模型，自发性动物模型的应用价值很高，但由于价格昂贵，饲养条件要求严格和不易成模等原因得不到广泛应用；实验性动物模型的制备方法包括胰腺切除、药物诱发、食物诱发等。其中药物诱发由于操作简单、价格低廉及成模率等优点在糖尿病动物模型中应用最为广泛，常用药物为链脲佐菌素(STZ)。它是一种广谱抗菌素,具有抗菌、抗肿瘤的性能和致糖尿病的副作用。STZ导致糖尿病的机制为[6]:STZ具有活拨的烃基结构,可以直接损伤胰岛β细胞DNA,刺激其释放H2O2,过量的H2O2及其转化形成的烃自由基引起细胞DNA断裂,增加脂质过氧化物水平,抑制胰岛素的释放[7]。有研究表明,STZ对破坏胰岛β细胞具有高度特异性的毒性作用,造模成功后较稳定,死亡率低。有研究指出,大鼠腹腔注射STZ成模率可达到90%,并：腹腔注射较尾静脉注射操作简单,准确快速,因此现多采用腹腔注射STZ法制作糖尿病模型。本研究结果发现,糖尿病模型大鼠成模后,血糖值高于造模成的随机血糖标准且较稳定。通过统计学分析各时间点大鼠血糖变化,发现血糖变化起伏小。从而也证明了STZ确为造模效果明确、造模稳定、成活率较高的胰岛细胞破坏药物。总之,本研究认为一次大剂量STZ注射制备糖尿病模型的方法使用简单,造模效果好,成活率高。

造模动物的选择：常用于制作骨质疏松模型的动物油犬、羊、猪、大鼠、小鼠和兔等[8]，由于大鼠与人类骨骼的病例生理相似且比较经济，所以，本研究采用大鼠制作1型糖尿病性骨质疏松动物模型。

造模动物种属、性别的选择：STZ诱发糖尿病的作用具有种属差异性，wistar糖尿病鼠少数可自发缓解，但少见SD大鼠自发缓解的报道，提示SD大鼠可能优于wistar鼠。此外有报道SD大鼠成模率也高于wistar鼠，但无显著统计学意义[9]。综合文献报道，在本实验中，我们选择了SD大鼠。此外Mordes[10]等报道，选用雄性大鼠制备模型的成模率明显高于雌性大鼠。故在本实验中，我们选择雄性大鼠。

造模动物年龄选择：大鼠寿命一般为2～3年，3月龄的大鼠已达到性成熟，6月龄大鼠才能真正达到骨成熟，17月龄即进入老年时期。本实验主要研究多发于青少年的1型糖尿病性骨质疏松，故选择小于3月龄大鼠制作1型糖尿病模型是合适的，本实验动物选择的是6～8周的SD大鼠。为观察成模的稳定性，本实验观察了成模后16W各种指标的变化，结果显示该模型稳定性好。

骨质疏松模型的指标有骨密度、生物力学、骨组织形态、血清生化和尿生化，以及骨生成和吸收耦联中分子的变化。而骨组织形态计量学是用定量的方法分析骨组织结构改变的测量技术，能精确地测量骨组织结构和总体骨量的变化，是描述骨小梁结构变化的有效指标，为骨质疏松提供病理学证据，可作为诊断骨质疏松依据。本实验研究6-8周龄雄性大鼠1型糖尿病模型制备成功后，第1W开始骨量降低，第4W后发生急剧的下降，第8W已降低接近50%。1型糖尿病早期即开始出现骨质破坏，提示糖尿病性骨质疏松的预防和治疗应从发病初期即开始进行。

综上所述，利用一次大剂量STZ注射的方法，可以制备符合1型糖尿病特点的1型糖尿病大鼠模型，本研究从大鼠成模后第1W开始观察其骨形态学的变化，连续观察16W，揭示在糖尿病性骨质疏松症发生和发展过程中骨骼变化的规律，为临床预防和治疗I型糖尿病性骨质疏松提供动物实验依据。