慢性间歇低氧/复氧对大鼠骨代谢的影响

张刘生 李正芳 张英育 蒙雁飞 井燕河 刘维英

1.兰州大学第一临床医学院，兰州 730000 2.兰州大学第一医院，兰州 730000

阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合症(obstructive sleep apnea-hypopnea syndrome,OSAHS)患者睡眠时体内反复发生低氧/复氧损伤过程，使机体长期处于氧化应激状态，氧化与抗氧化体系失调，导致氧自由基及其代谢产物过量聚集[1]。近年来,OSAHS患病率在我国逐渐升高，已成为心血管系统发病率升高的独立因素[2]。氧化应激通过破坏成骨细胞和破骨细胞之间的平衡来影响骨代谢,进而引发骨质疏松[3]。间歇低氧作为骨质疏松的危险因素已受到高度关注,但间歇低氧诱发骨代谢指标改变的机制和动物实验鲜有报道。本研究通过间歇低氧/复氧模型的建造，测定间歇低氧/复氧条件下大鼠骨代谢指标骨矿盐含量、血清B-ALP、各部位BMD，氧化应激指标SOD、MDA水平，炎症反应指标IL-6、TNF-α表达水平来探讨间歇低氧/再氧可能诱发骨代谢改变的发病机制，为临床了解OSAHS患者继发骨质疏松的病理特征及其预防提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象

8周龄雄性SPF级SD大鼠20只，体质量180～220 g，由甘肃省中医学院动物中心提供。随机分为IH组和NC组，每组10只,用苦味酸分别对两组大鼠进行标记。

1.2 主要实验器材及试剂

1.2.1实验器材：动物饲养舱(苏州市冯氏实验动物设备有限公司),ASD-3D爱华电子计重秤(深圳爱华衡器有限公司),气体减压阀(上海沃原阀门有限公司),电磁式空气压缩机(浙江森森实业有限公司),H48S-S数显时间继电器(上海一开集团日科电器),电磁阀(浙江德力西电气有限公司),气体流量计(安徽桐城有机玻璃仪器制品有限公司),测氧仪(浙江新安江分析仪器二厂),双能X线骨密度仪(General Electric Company WI53717-1915 USA)，全自动生化分析仪(美国贝克曼库尔特公司)，日本日立716全自动生化仪， r-911全自动放免计数仪(中国科技大学实业总公司生产)。

1.2.2实验试剂：大鼠骨碱性磷酸酶酶联免疫试剂盒(美国ADL公司),动物饲料(北京科澳协力饲料有限公司),医用氮气，纯度>99%(兰州荣成有限责任公司)，医用氧气(兰州方圆建化有限责任公司),戊巴比妥钠盐溶液(上海静融生物科技有限公司)，血浆TNF-α、IL-6试剂盒(北京华英技术研究所)，血浆SOD、MDA试剂盒(北京华英技术研究所)。

1.3 造模方法

将IH组放入间歇低氧模拟舱内，向舱内循环充入氧气，氮气和压缩空气，循环周期为120 s,输入纯氮气30 s,静息10 s，输入纯氧气20 s，输入压缩空气60 s,氮气、氧气、压缩空气和静息期的转换由时间计电器定时控制电磁阀来完成。低氧时舱内氧浓度最低6～7%，维持30s；复氧后舱内氧浓度维持在20～21%，维持60秒。实验时间设置为每天8 h(9am-17 pm)，每周7天，共8周。将NC组大鼠在每天相同时间置入相同规格的动物饲养舱内，舱内通入相同流量的压缩空气，维持舱内氧浓度20-21%。所有动物饲养舱内设置饮食设备，实验期间大鼠正常饮食。每天观察大鼠饮食、睡眠、精神、活动情况，每天采用ASD-3D爱华电子计重秤分别称重IH组和NC组大鼠体重[4]。

1.4 试验方法

间歇低氧/复氧造模8周后，用戊巴比妥钠盐溶液麻醉，打开胸腔，右心房取血，血液离心后取上清液保存于-80℃的冰箱,利用全自动生化分析仪测定血清B-ALP水平，日本日立716全自动生化仪比色法检测血浆SOD、MDA， r-911全自动放免计数仪放射免疫法检测血浆TNF-α、IL-6；去除骨骼附着的肌肉和结缔组织，液氮冷存送检,利用双能X线骨密度仪分别测定全身BMD、股骨BMD及骨矿盐含量。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 大鼠骨代谢指标水平变化

与NC组相比，IH组血清B-ALP水平升高(P<0.05),骨矿盐含量水平显著降低(P<0.01)，都有统计学差异。见表1。

组别nB-ALP(U/L)骨矿盐含量(g)NC组10171.25±21.462.02±1.69IH组10200.40±49.41∗0.47±0.04∗∗

注：与NC组相比，*P<0.05，**P<0.01
Compared to NC group*P<0.05,**P<0.01

2.2 大鼠各部位BMD水平变化

与NC组相比，IH组全身BMD降低(P<0.05)，股骨BMD显著降低(P<0.01)，差异都有统计学差异。见表2。

组别n全身BMD(g/cm2)股骨BMD(g/cm2)NC组100.214±0.0270.208±0.030IH组100.179±0.020∗0.148±0.002∗∗

注：与NC组相比，*P<0.05，**P<0.01
Compared to NC group*P<0.05,**P<0.01

2.3 大鼠血清氧化应激指标水平变化

与NC组相比，IH组SOD水平显著降低(P<0.05)，MDA水平升高，差异均具有统计学意义。见表3。

组别nSOD(U/ml)MDA(nmol/ml)NC组1067.37±6.485.16±0.31IH组1052.78±6.24∗6.94±0.33∗∗

注：与NC组相比，*P<0.05,**P<0.01
Compared to NC group*P<0.05,**P<0.01

2.4 大鼠血清炎症反应指标水平变化

与NC组相比，IH组IL-6和TNF-α水平显著升高(P<0.05)，差异均具有统计学意义。见表4。

组别nIL-6(pg/ml)TNF-α(pg/ml)NC组10166.34±30.6558.16±10.12IH组10261.21±34.44∗76.24±7.72∗∗

注：与NC组相比，*P<0.05,**P<0.01
Compared to NC group*P<0.05,**P<0.01

OSAHS是最常见的呼吸睡眠呼吸疾病,多数患者存在肥胖或上呼吸道如鼻咽部位的狭窄,长期间歇性低氧引起低氧血症和高碳酸血症及睡眠结构紊乱，进而使机体发生一系列病理生理改变和靶器官功能受损，如心血管系统受损、脑卒中、代谢综合征、心理异常、情绪障碍等疾病,目前已引起临床高度重视。大量研究表明，OSAHS引起的间歇低氧与高血压、冠心病、糖尿病视网膜病变等都有良好的相关性[5]，金常娥[6]等研究显示，OSAHS与骨质疏松有良好的相关性。Utting JC等[7]的研究表明,长期低氧可以诱发机体骨代谢平衡失调，影响成骨细胞增殖和促进破骨细胞吸收,骨量降低,骨结构发生变化，进而继发骨质疏松症。而间歇低氧/复氧可以诱导机体产生氧化应激状态和炎症反应，使机体发生一系列代谢紊乱，因此笔者猜测间歇低氧/复氧产生的氧化应激状态和炎症反应可能是造成OSAHS患者发生骨质疏松的重要原因。

本研究通过建立大鼠间歇低氧/复氧模型,模拟OSAHS患者在睡眠呼吸过程中发生的间歇低氧/复氧过程,旨在探究慢性间歇低氧/复氧对骨代谢的影响和引起骨代谢变化的机制。结果表明,IH组大鼠全身BMD、股骨BMD和骨矿盐含量显著低于NC组，且差异具有统计学意义(P<0.05),表明间歇低氧/复氧过程使大鼠骨代谢发生变化，增加了骨质疏松的危险性,这和Kulak等[8]对于OSAHS患者的研究结果一致;IH组血清B-ALP高于NC组,且差异具有统计学意义(P<0.05),证实了间歇低氧/复氧可以诱导SD大鼠骨代谢平衡失调,破骨细胞吸收增强,成骨细胞活性降低，导致释放血清B-ALP水平升高，和Htomiyama R等[9]研究结果一致。长期慢性间歇低氧/复氧过程，骨组织骨矿盐含量流失,骨密度降低，进而出现骨质疏松症。

目前许多国内外研究报道间歇低氧/复氧引起的氧化应激状态是OSAHS患者机体发生损伤的关键因素，长期间歇低氧/复氧使机体线粒体减少,导致活性氧自由基(ROS)在体内堆积,同时引起氧化能力增强，抗氧化能力下降,氧化与抗氧化失衡[10],从而引起机体损伤。有研究显示间歇低氧暴露后大鼠体内炎性标志物TNF-α、IL-6升高,抗氧化剂SOD和还原型谷胱甘肽(GSH)显著降低[4],表明间歇低氧/复氧使机体氧化物堆积和抗氧化能力减弱,引发氧化应激反应。实验结果显示，IH组大鼠氧化应激指标SOD水平显著降低，MDA水平升高，差异均具有统计学意义(P<0.05)，炎症反应指标IL-6和TNF-α水平显著升高(P<0.05)，差异均具有统计学意义，这和上述研究结果一致，表明慢性间歇低氧/复氧大鼠体内发生了氧化应激和炎症反应。相关研究表明，氧化应激与炎症反应有一定相关性，OSAHS患者体内含有大量ROS,ROS可以上调控制炎症反应的转录因子，引起炎症因子和细胞毒性T细胞产生，TNF-α、IL-6、IL-8产生增加[11]。Yokoe等[12]表明,OSAHS患者体内IL-6和hs-CRP(超敏C反应蛋白)水平升高，且与间歇低氧/复氧呈正相关，持续正压通气治疗有效。

综上表明：慢性间歇低氧/复氧诱发机体产生的氧化应激和炎症反应可能是机体骨代谢发生变化的重要机制。但是间歇低氧/复氧引发机体骨代谢机制相当复杂,有期刊曾报道内分泌失调如甲亢、甲减、糖尿病、绝经等可引起机体骨代谢失衡、B-ALP和BMD发生变化，进而增加了骨质疏松的危险性,因此对于间歇低氧/复氧诱发机体骨代谢的原因仍需进一步深入探究。

总之，间歇低氧/复氧大鼠体内存在氧化应激和炎症反应可能是骨密度降低，骨量流失,发生骨质疏松的重要机制,也可能是OSAHS患者体内发生一系列代谢紊乱的基础。通过干预OSAHS患者低氧状态和炎症反应,对OSAHS患者骨质疏松症的预防和治疗具有指导作用。