Th17细胞及相关因子IL-17与绝经后骨质疏松的相关性研究

刘连勇 陆志仁 游利 胡晓晖

1.上海市浦东新区浦南医院内分泌科，200125 2.江苏省苏州大学医学院研究生院，215123 3.上海市宝山区淞南社区服务中心，上海 200441 4.上海市第一人民医院，上海 200080 5.上海市浦东新区浦南医院脊柱外科，200125

绝经后骨质疏松症(Postmenopausal osteoporosis，PMO)是一种由于雌激素缺乏导致骨量减少及骨组织结构变化，从而使骨脆性增多的疾病。该病主要发生在绝经后妇女，临床上易于骨折，以及由骨折引起疼痛、骨骼变形等症状，严重地影响患者的身体健康和生活质量，甚至缩短寿命。研究认为，绝经后骨质疏松被认为可能是一种炎症过程，许多促进炎症和T细胞衍生的细胞因子对骨量的丢失起到了重要作用[1]。然而目前，绝经后骨质疏松症的发病过程中的机制尚未完全清楚。

CD4+T细胞是人体免疫系统中的一种重要免疫细胞，在抗原与抗原提呈细胞(Antigen presenting cell，APC)存在时可以主要主要分化为Th1，Th2，Th17及Treg细胞[2-5]。其中，Th17细胞是一群通过产生细胞因子白介素-17(IL-17) 发挥多种生理病理学功能的细胞亚群[6]，目前的研究发现，Th17细胞通过分泌IL-17在风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA) 中起作用，并与TNF-α 共同作用时增强了骨转换和炎症的发展的过程[7]。此外，研究发现 IL-17 是关节炎等其他影响骨量疾病的一个很重要的介导因素，并可以作治疗上述疾病的重要的靶分子[8]。然而迄今，对于Th17细胞及相关因子在绝经后骨质疏松进展中的具体作用及机制尚不完全明了。

因此，本研究通过对比绝经后骨质正常人群及绝经后骨质疏松患者的外周血Th17细胞、分泌的细胞因子以及相应的转录因子水平，分析探讨绝经后骨质疏松患者中Th17细胞与骨密度以及血清钙可能存在的关系。

1 对象与方法

1.1 临床资料

选择2011年7月～2014年7月来我院治疗的60例女性绝经后骨质疏松患者为研究组，选取同期来我院体检的60例女性绝经后骨量正常人群为对照组。绝经后骨质疏松组纳入标准：①自然绝经1年以上；②年龄50-65岁，平均61 .3 岁。排除标准：①各种骨软化症、钙与维生素D缺乏症及肾小管酸中毒；②原发性、继发性甲状腺机能亢进；③恶性肿瘤的骨转移；④多发性骨髓瘤；⑤脊髓血管瘤；⑥化脓性脊髓炎；⑦有明显限制运动性疾病者，慢性内科疾病以及内分泌疾病引起继发性骨质疏松者；⑧服用雌激素、肝素、皮质类固醇激素、二磷酸盐等与骨质疏松有关的药物[9]。研究组和对照组的研究对象的性别、年龄等一般资料具有可比性，差异均无统计学意义(均P>0.05)。

1.2 方法

1.2.1两组人群外周血Th17细胞流式染色：两组人群均在早餐空腹采集外周血5 ml，加入EDTA抗凝剂，加入红细胞裂解液裂解红细胞后，以完全1640培养液调节浓度至1×106细胞/ml。离心并重悬于100 μL PBS中，加入CD3-APC(eBioscience，0.25 mg/ml)和CD4-FITC(eBioscience，0.2 mg/ml)抗体，混匀后室温避光孵育30 min，以PBS缓冲液洗完2遍后，加入破膜固定工作液1 ml后4度避光孵育30 min。离心后，重悬于100 ul permeabilization buffer中，加入IL-17A-PE(BioLegend，0.25 mg/ml)，4℃避光孵育45min，以PBS缓冲液洗2遍后， 500 μL缓冲液重悬细胞后用流式细胞仪(FACS Calibur，美国BD公司)检测。

1.2.2ELISA法检测两组人群血清中IL-17、IL-6、TGF-β1水平：人的IL-17、IL-6、TGF-β1试剂盒均购自美国eBioscience公司，检测流程严格按照试剂盒的说明书。

1.2.3采用RT-PCR法检测两组人外周血中转录因子RORγT的mRNA水平：外周血离心后提取上层血浆200 μl，加入到1 ml Trizol充分匀浆，按照说明书的要求抽提总RNA，所得RNA溶于30μl DEPC水中。提取的总RNA经紫外分光光度计进行定量分析。然后再采用Femantes逆转录试剂盒逆转录成cDNA，于-20℃保存备用。本实验PCR反应条件：95℃变性20 s，然后60℃20s和70℃1 s进行40个循环。RORγT引物序列：正义序列：5’-GCAGCGCTCCAACATCTTCT-3’， 反义序列：5’-ACGTACTGAATGGCCTCGGT-3’；内参GAPDH引物序列：正义序列：5’-GCATGGGTCAGAAGGAT TCCTc-3’， 反义序列：5’-TCGTCCCAGTTGGTG ACGAT-3’。使用ABI公司的7300型号Real-Time PCR仪器进行扩增，所得结果采用2-ΔΔCt法进行相对定量分析[10]。

1.3 骨密度测量

应用美国通用PRODIGY双能X线吸收仪检测测定 L1-4椎体、股骨颈、桡骨远端的骨密度BMD值，以面积骨密度值准确性(0.5%-1%)g/cm表示。腰椎1-4，股骨颈和桡骨远端检测的变异系数(CV)分别为1.2%，1.2%，1.4%。

1.4 统计学及作图分析

所有数据采用SPSS19.0软件统计分析，计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用两独立样本t检验，相关分析采用Pearson相关分析法。以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 绝经后骨质疏松患者及对照人群外周血Th17细胞水平比较

流式细胞术检测显示，绝经后骨质正常对照组人群外周血中Th17细胞比例为(0.67±0.39)%，显著低于绝经后骨质疏松患者中的Th17细胞比例(2.10±0.83)%，差异有统计学意义(t=12.08,P=0.000)。提示Th17细胞可能参与绝经后骨质疏松的发展。见图1。

图1 两组人群外周血中Th17细胞比例(***，P<0.001)Fig.1 The proportion of Th17 cells in peripheral blood in the two groups.

图2 两组人群外周血血清中IL-17蛋白水平及外周血RORγT的mRNA水平Fig.2 The levels of serum IL-17 protein and RORγT mRNA in peripheral blood in the two groups.

2.2 绝经后骨质疏松患者及对照人群血清中IL-17及外周血中转录因子RORγT的mRNA水平

ELISA结果显示，绝经后骨质正常对照组人群外周血中IL-17水平为(19.51±11.21)pg/ml，显著低于绝经后骨质疏松患者血清中IL-17水平(27.54±10.48)pg/ml，差异有统计学意义(t=4.05,P=0.000)。RT-PCR检测结果显示，与绝经后骨质正常对照组人群比较，绝经后骨质疏松患者外周血RORγT mRNA水平显著高于正常人群，差异有统计学意义(t=15.12，P=0.001)。提示了Th17细胞可能通过激活转录因子RORγT以及分泌细胞因子IL-17及来参与绝经后骨质疏松的发展。见图2。

2.3 绝经后骨质疏松患者及对照人群外周血血清IL-6及TGF-β水平比较

ELISA结果显示，绝经后骨质正常对照组人群外周血血清中IL-6水平显著低于绝经后骨质疏松患者，差异有统计学意义(t=8.99,P=0.000)；此外，绝经后骨质正常对照组人群外周血中TGF-β水平显著低于绝经后骨质疏松患者，差异有统计学意义(t=4.71,P=0.000)，见表1。

表1 两组外周血血清中IL-6及TGF-β的关系Table 1 Relationship between serum IL-6 and TGF-β

注：与对照组比较，△t=8.99,P=0.000；▼t=4.71,P=0.000

2.4 绝经后骨质疏松患者及对照人群外周血中Th17细胞与骨密度的关系

与对照组比较，绝经后骨质疏松患者的BMD显著降低，差异有统计学意义(t=6.14，P=0.000)，见表2。进一步Pearson相关分析显示，绝经后骨质疏松患者血清中IL-17与骨密度呈显著负相关(r=0.671，P<0.05)。见图3。

表2 两组外周血中Th17细胞与骨密度的关系Table 2 Relationship between Th17 cells in peripheral blood and bone mineral density.

注：与对照组比较，△t=6.14，P=0.000。

图3 绝经后骨质疏松患者血清中IL-17与骨密度的相关分析Fig.3 Correlation analysis of serum IL-17 and BMD in PMOP patients

3 讨论

骨质疏松症(osteoporosis，OP)是多种原因引起的一类以骨量减少、骨的微观结构破坏，从而导致骨的脆性增加，易发生骨折为特征的一种全身代谢性骨骼疾病。随着近年来社会的老龄化以及生活水平的提高，骨质疏松症的患病率逐年增加。目前的研究认为，骨质疏松症的发病的诱导机制主要包括雌激素缺乏、维生素C、D缺乏、甲状腺功能亢进症以及胃肠吸收功能障碍等[11, 12]。绝经后骨质疏松症是一种因绝经后卵巢合成雌激素减少导致骨质疏松症。研究发现，妇女绝经后机体内的细胞因子，如IL-1、TNF-α、IL-6 和巨噬细胞集落刺激因子的表达水平显著增加，并与骨丢失密切相关[13, 14]。

IL-17是一类主要由Th17细胞诱导下产生的细胞因子，IL-17在抵抗胞外病原体感染的宿主防御以及各种自身免疫性疾病发病中发挥极其重要的作用[15, 16]。在骨关节炎模型研究发现，IL-17可以通过与 TNF-α的协同作用共同参与关节炎的炎症反应及骨转换过程[7]。DeSelm CJ等在小鼠模型中发现，经历卵巢切除术(OVX)的野生型小鼠由于雌激素缺失可以导致骨小梁减少，而IL-17受体缺失的小鼠却具有较完整的骨小梁[17]，从而提示了IL-17在雌激素缺失的小鼠中可能具有促进骨质疏松作用。本研究通过对人群样本研究发现，在绝经后骨质疏松患者外周血中Th17细胞及IL-17水平显著高于对照人群，提示Th17细胞可能通过产生IL-17参与绝经后骨质疏松的免疫应答，这与以往研究发现的产生IL-17的Th17细胞在雌激素(estrogen，E2)缺失的小鼠体内水平增加与骨丢失一致的结果相符[18]。我们进一步检测了RORγT的mRNAs水平，该指标是Th17细胞功能的关键转录因子[19]，结果发现，绝经后骨质疏松患者血清中RORγT的mRNA水平均高于对照人群，从而进一步验证了以上结果。由于转化生长因子β(TGF-β)和IL-6在诱导T细胞向Th17细胞分化的过程中发挥重要的作用[20]，因此，本研究亦观察了绝经后骨质疏松患者体内以上两种细胞因子水平，结果亦发现，在绝经后骨质疏松患者外周血中TGF-β及IL-6水平显著高于对照人群。Islander U 等学者在类风湿性关节炎小鼠模型中发现的IL-6 具有促骨质疏松特性[21]，且Grainger, D.J等学者发现TGF-β在美国的骨质疏松妇女血清中表达增加[22]，均支持了本研究的结果。

目前关于Th17分泌的IL-17影响绝经后骨质疏松的机制尚未完全明了，因此，我们通过分析了绝经后骨质疏松患者体内IL-17水平与骨密度的关系，探讨IL-17对于绝经后骨质疏松的影响机制。结果发现，绝经后骨质疏松患者血清中IL-17越高，骨密度越低，从而提示了IL-17可能通过影响骨密度参与绝经后骨质疏松发病的过程。

综上所述，Th17细胞及其相关因子在绝经后骨质疏松致病中发挥着重要的功能，Th17细胞及其相关因子的增加，可能是促进绝经后骨质疏松发生的重要原因，降低绝经后骨质疏松患者体内增加的IL-17可能对绝经后骨质疏松治疗及预后具有重要的临床意义。