Smad与骨质疏松症

陈伟健 谢炜星 温龙飞 李钺 任东成 晋大祥 丁金勇 龚水帝 郭惠智 陈哓俊

1.广州中医药大学，广东 广州 510405 2.广州中医药大学第一附属医院，广东 广州 510405

OP是一种常见的全身性骨代谢疾病，以骨量减少和骨组织微细结构破坏为特征，并进一步导致患者骨质脆性增加和易于发生骨折。骨骼是一个动态的活性组织，它需要通过不断的重塑来维持骨矿化平衡及骨结构的完整，持续的骨重建是保护骨骼健康的重要前提，由OC介导不断吸收骨基质，随后由OB负责替代新骨。在骨重塑的过程中骨形成和骨吸收保持一种动态平衡，称为骨稳态。OP就是由于这种骨稳态被打破而导致的。OB和OC之间的相互调节，是保持骨形成和骨吸收之间骨稳态的基础。

Smad蛋白家族是近年通过基因筛查的办法在无脊椎动物中鉴定出来的新的细胞内信号传导蛋白。TGF-β通路与BMP通路是调控骨稳态的重要通路。随着不断深入研究 Smad 蛋白家族发现，Smad 主要参与TGF-β通路与BMP通路的信号传导，对OB与OC的形成与分化发挥重要作用。

1 Smad蛋白的介绍

1.1 Smad蛋白家族的发现

人们最初通过对果蝇进行基因筛查的研究，发现了在TGF-β家族信号通道下游的 Mad 多肽有一个高度保守且未知的结构域，而这一结构域与从线虫中分离的 3 种 cem-1、cem-2、cem-3 多肽相比较，具有高度的相似性， Mad 从此就作为了一个新的蛋白质家族出现在人们面前。接着人们又通过基因筛查在新小杆线虫上发现 Sma-2、Sma-3、Sma-4 都有一个保守的结构域，编码属于同一个蛋白家族，而且都处于 TGF-β 信号通道的下游，结构与Mad蛋白相近，说明Sma蛋白与Mad蛋白联系密切。后来进一步研究发现Mad蛋白和Sma蛋白都作用于丝氨酸/苏氨酸激酶受体(分别称为Ⅰ型受体和Ⅱ型受体)下游，因此人们将 Mad蛋白 和 Sma 蛋白及其类似物统称为 Smad 蛋白家族[1]。

1.2 Smad蛋白的分类

目前已经有 9 种 Smad 成员相继被报道，分别用Smad 1～ Smad 9表示。按照结构和功能，Smad 可以被分为 3类: 第一类，受体调节的 Smads(R-Smads)，包括 Smad 1、2、3、5、8、9。Smad 2和Smad 3是TGF-β或活化素的特异性中介物，Smad 2和Smad 3因TGF-β和TGF-βⅡ型受体与激活素受体样激酶类ALK4/5/7之间形成的复合物或活化素和活化素受体2发生磷酸化，负责参与TGF-β和活化素信号传导途径； BMPs I型受体ALK1/2/3/6、BMPs II型受体或活化素受体2形成的复合物则可激活Smad 1、5、 8，可能还有Smad 9，参与传导BMP信号传导。较早的研究已证实BMP-2/4就是通过Smad 1、5、8传递信号。第二类，共同介导的Smads(Co-Smad)，目前发现只有一种，就是 Smad 4。Smad 4就像一个中央传感器，既不能被磷酸化，也不能结合TGF-β受体或BMP受体，但它几乎能与所有激活的 R-Smads 形成异源的多聚复合物，并因此参与和调节TGF-β信号转导。因为Smad 4有一个富含脯氨酸的Smad 4活化区(Smad 4 activiation domain,SAD) 能够调节转录激活和抑制因子的相互作用，这是激活 R-Smads 所依赖的转录反应所必需的。第三类，抑制性的 Smads(Ⅰ-Smads)，包括 Smad 6和Smad 7。在大多数静息细胞中，Ⅰ-Smads 位于细胞核中，当受到 TGF-β 刺激或泛素化调节因子Smurf1 过度表达时，Smad 6、7 从细胞核进入细胞质，Ⅰ-Smads 与Ⅰ型受体结合，竞争性的干扰 R-Smads募集和磷酸化，并同时抑制R-Smads 和 Co-Smad 复合物的形成和活性。Smad 6、7 还可以与泛素化连接酶Smurf E3 相作用，使其结合到Ⅰ型受体，导致受体降解，终止信号传导。Smad 7 也能直接在细胞核上发挥作用，抑制特定基因的转录。Ⅰ-Smads蛋白可以作为TGF-β信号转导自我调节的一种负反馈信号，因为TGF-β可以诱导Ⅰ-Smads的mRNA的转录反应，所以Ⅰ-Smads能起到负反馈的作用紧密地控制TGF-β信号转导。Ⅰ-Smads能抑制Smad蛋白介导的信号转导，其中Smad 6主要抑制BMP信号转导，而Smad 7则能抑制TGF-β和BMP信号转导[2-4]。

1.3 Smad蛋白的结构特征

Smad蛋白的N区和 C区有一个高度保守的结构域，分别称为MH1(Mad homology domain-1) 和 MH2(Mad homology domain-2),富含脯氨酸(Pro)。 MH1 和 MH2 之间是氨基酸序列与长度可变化的中间连接区(L)。MH2是功能效应区，MH2 的功能包括与I 型受体发挥效应，形成 Smad 多聚复合物，结合其他转录共激活剂或共抑制剂。MH2在所有的 Smad 蛋白中是高度保守的。MH1是MH 2的功能抑制区, 在未激活时，MH1抑制 MH2 的功能；当激活后，MH1 负责结合到特异性的 DNA 序列。与MH2不同，MH1 只有在 R-Smad 和 Co-Smad中才是保守的。Smad蛋白的MH 1与MH2以结合状态存在，当受体与配体结合被活化后两者解离，形成Smad复合体向核内移行，在核内蓄积引起靶基因的转录。目前L区的功能尚不清楚[5]。

1.4 Smad通路作用机制

尽管Smad通路存在大多数的细胞类型和组织，但它是受TGF-β/BMP激活的额外通路。在TGF-β通路中，当TGF-β 家族配体结合到Ⅱ型受体就激活Ⅱ型受体激酶，然后磷酸化Ⅰ型受体激酶上游富含甘氨酸 /丝氨酸的GS 区，GS 区的磷酸化又会激活Ⅰ型受体激酶，导致Ⅰ型受体发生自我磷酸化和细胞内的 R-Smads一过性地与Ⅰ型受体直接进行配体结合形成复合物，R-Smads的 C 区的Ser-Ser-Val/Met-Ser 序列(SSXS 区)发生磷酸化。磷酸化的 R-Smads与Ⅰ型受体分离并与 Smad4 形成复合物。在BMP通路中，BMP首先与二型受体(BMP RⅡ)结合使其磷酸化，然后活化的BMP RⅡ磷酸化一型受体(BMP R I)并与其结合形成复合物。活化的受体复合物进一步激活一系列下游受体调节R-Smads，磷酸化的R-Smads与受体分离，与Smad4结合形成复合物。通过TGF-β通路和BMP通路形成的这些复合物转移到细胞核与不同的 Smad结合原件(Smad-binding elements，SBE)、DNA 转录因子、转录共激活剂或共抑制剂结合，并向核内移行,在核内蓄积引起正性或者负性调控调控靶基因的表达[6-8]。Ⅰ-Smads 的N区与其他通路的特异性有关并且缺乏MH1，能与R-Smad竞争TGF-β和BMPs的I型受体，从而抑制R-Smad的磷酸化，抑制Smad通路，具体见图1[9]。

2 Smad与骨质疏松症

随着全球人口老龄化的趋势，OP在全球的发病率也逐年增高，严重威胁着老年人的健康。OP的发病机制主要是由OB介导的骨形成与OC介导的骨吸收之间的骨稳态失衡。OC相对比OB活跃，即骨吸收的趋势大于骨形成的趋势。Smad主要通过TGF-β/BMP通路直接参与诱导OB与OC的生成、分化，在调节骨代谢方面扮演着不可或缺的角色。

2.1 Smad蛋白与成骨细胞

负责骨形成活动的OB是由骨髓间充质干细胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells，BMSCs)分化而来的，OB增殖分化由多种生长因子调控，包括TGF-β、BMP、Smad等。TGF-β与BMP通路都能促进骨形成，而两者的信号转导都由Smad直接介导。

2.1.1在BMP通路中Smad蛋白与成骨细胞

BMPs是诱导OB分化和骨形成的有效的亲骨因子，在动物中已被证实能诱导骨形成。BMP-2通过增加OB分化的标志酶-碱性磷酸酶ALP活化和骨钙蛋白等基因的表达，诱导BMSCs向OB分化，促进骨形成。在所有Smad蛋白中，与成骨细胞分化关系密切的是 Smad 1和 Smad 5。Smad 1、5通过与BMP-Ⅰ A型或Ⅰ B型受体结合后直接活化、磷酸化， 接着 与2个或1个R-Smad 和 1 个Smad 4 以异源三聚体或异源二聚体的形式进入细胞核内，作用于成骨细胞特异性转录因子 runx2、Osterix等基因序列并上调其表达[6-8]。另外，Smad 1或Smad 5能特异地与OB分化密切相关的PEBP 2αA/AML 3 /CBFA 1基因启动子结合，一起诱导OB分化。在BMP-2缺乏的情况下，Smad 1或Smad 5过表达，也可以诱导ALP的活化和OB分化。特异性地敲除Smad1会引起骨量的减少。部分学者发现，mi R-155在BMP-2刺激后表达下调，具有抑制成骨细胞分化为骨细胞的能力，其机理正是通过与Smad 5 mRNA的3’-UTR端结合抑制其基因表达[10]。Liu等[11]通过收集50位骨折的老年患者的骨样本，发现随着年龄增长，与年龄相关的PLEKHO1 mRNA水平上升会减少Smad 1/5 (p-Smad1/5)的磷酸化，抑制OB的生成。最近有学者研究发现，Notch 信号通路的配体DLL1 在体内外都具有促进 BMP9 诱导 BMSCs 成骨分化的作用，且该效应可能通过影响 BMP9 信号通路的多个环节来实现。DLL1 能促进 BMP Ⅰ型受体 ALK2 的表达，同时也能上调 Smad1 /5 /8 磷酸化水平及 SBE 的转录活性[12]。这些研究发现都说明了Smad蛋白是直接参与BMP通路诱导OB形成过程中的信号通路，OB的形成与磷酸化的Smad密切相关。

2.1.2在TGF-β通路中Smad蛋白与成骨细胞

除了BMP通路， Smad也能通过TGF-β通路促进OB形成。在该通路转导过程中，TGF-β先结合其II型受体，再激活其I型受体，组成受体复合物，受体复合物携带信号进入细胞膜后，因 Smad 受体激活锚蛋白在细胞膜及早期内涵体膜上已锚定 Smad2或Smad3 蛋白，激活的TGF-β识别并结合活化Smad 2或Smad 3 蛋白[13]。Smad 2或Smad 3活化后与Smad 4形成复合物异位入核，启动细胞内信号反应的级联传导，通过MH1区的发夹样结构与DNA上的SBE直接结合，诱导和调节靶基因转录，影响成骨细胞的增殖、分化及I型胶原蛋白的合成。有学者报道，葛根素促进骨形成正是通过刺激Smad 2/3 mRNA的表达和刺激TGF-β1的分泌和合成[14]。此外，TGF-β还可诱导OB自身表达并诱导 BMP-2 在OB中的表达，增加其成骨能力。

2.2 Smad蛋白与破骨细胞

负责骨吸收活动的OC起源于造血干细胞， OC的形成依赖于核因子κ B受体活化因子配体(receptor activator for nuclear factor-κ B Ligand，RANKL)和集落刺激因子1(colony stimulating factor -1，CSF-1)的协同作用，两者都源于OB的分泌。CSF-1在未成熟的OC表面结合其受体激活信号通路对于破骨细胞前体的增殖与存活必不可少；而RANKL对于OC的成熟、分化更是起核心作用，RANKL在破骨细胞前体细胞表面与RANK通过可溶性或膜结合，促使成熟OC的形成，激活和存活。

2.2.1在TGF-β通路中Smad蛋白与破骨细胞

至今为止，人们知道TGF-β对OC的生成有密切联系， TGF-β可以直接作用于骨髓巨噬细胞(bone marrow macrophages，BMMs)并促进OC的形成， RANKL 与巨噬细胞集落刺激因子结合诱导OC生成，在这一过程中内源性的TGF-β是关键。TGF-β能招募破骨细胞前体到骨环境中并在RANKL的帮助下推动OC分化，促进骨吸收。在破骨细胞分化过程中，TGF-β与其II型受体结合并招募和磷酸化I型受体，导致smad 2和Smad 3的磷酸化，负责TGF-β通路下游的信号转导。具体而言，TGF-β增强了RANKL介导smad 2或Smad 3与Smad 4组成的复合体易位到细胞核并与Nfatc1靶基因结合，驱动Nfatc1的表达，这是调控OC分化的关键因素，在这过程中，肿瘤坏死因子受体连接因子6与 Smad 3的MH2结构域结合也起着关键的作用[15]。然而有趣的是，TGF-β又会影响BMMs周围的基质细胞而间接抑制OC的形成。其次，TGF-β能促进OB分泌骨保护素，通过结合RANK而影响RANK与RANKL的相互作用，进而抑制OC的活性和分化[16]。Yasui等[17]研究发现当阻挡Smad通路后，RANKL诱导OC形成受到抑制，此时激活的突变Smad 2或Smad 3能翻转这一效应。免疫沉淀分析发现，Smad 2/3直接与TRAF6-TAB1-TAK1组成复合物，该复合物能刺激RANKL并对OC分化起关键作用。阻挡TGF-β信号通路，却未发现TRAF6-TAB1-TAK1复合物。进一步分析发现Smad3的MH2区对于TRAF6-TAB1-TAK1 形成复合体是必要的。可见，TGF-β刺激激活Smad2或 Smad 3，Smad 2或 Smad3直接与TRAF6-TAB1-TAK1结合形成复合物，可促使RANKL诱导OC形成。

2.2.2在BMP通路中Smad蛋白与破骨细胞

在BMPs中，BMP-2与OC的形成有密切关系，并且BMP-2可刺激OC的骨吸收活动。BMP-2 主要可以诱导CSF-1的表达促进OC的形成，而专门介导BMP通路的Smad与CREB结合蛋白协同作用能增加CSF-1 的表达，CSF-1 的表达的上调能促进OC的生成。而与OC形成和分化密切相关的RANKL，BMP-2在白细胞介素-1α的作用下可增加其表达以此来促进OC的形成，并提高OC的存活率和促进OC的分化。然而BMP-2自身并不具备使OC的存活率提高的作用。Yoshikawa[18]等发现在敲除Smad1的初代OB中BMP-2所诱导RANKL mRNA的表达受到抑制，导致OC的形成减少。

除了负责介导TGF-β信号通路的Smad 2或 Smad 3和负责介导BMP通路的Smad 1和Smad 5被报道与OC的形成有关系外，Smad 4作为Co-Smad与因TGF-β/BMP刺激而磷酸化的R-Smads结合形成复合物参与转录反应，也与OC的形成密切相关。Amy等[19]研究发现分别敲除Smad 1、4、5后，OC的骨吸收的活动减弱，OC分化的标记物表达减少，由此可见Smad 1、4、5的表达对于OC的分化是必要的。另外，Li 等[20]用敲除Smad7基因外显子1的小鼠模拟Smad7部分功能缺失，与正常小鼠对照，左股骨干骺端的形态和长度没有明显差别，但骨量与骨小梁比对照组减少，在显微镜下发现OC比对照组多。由此说明，Smad7部分功能缺失会抑制骨形成，促进骨吸收。由此看出，Smad7似乎也与OC的形成有某种密切的关系。

3 Smad在骨质疏松研究中的前景

综上所述， OP的发病机制主要是由OB介导的骨形成与OC介导的骨吸收之间的骨稳态失衡。而Smad在不同因素下通过TGF-β/BMP通路直接参与诱导OB与OC的生成、分化，在调节骨代谢方面作用显著。然而目前对Smad的研究仍处于初级阶段，对骨形成与骨吸收的研究主要还只是局限在动物研究方面，较少直接对骨质疏松患者进行研究探讨，对其精确的调节机制也未完全清楚，在TGF-β/BMP通路下参与调节的Smad都有促进OB和OC形成的作用，究竟在其中哪些因素能诱导Smad促进OB形成，哪些因素能诱导Smad促进OC形成，现在也未完全清楚。今后仍需通过相关研究，探究Smad在骨形成和骨吸收方面发挥作用的具体机理和影响因素，如何促进OB的形成而又避免促进OC的形成，更是今后防治骨质疏松症的药物研究的一个热点。