丹参素拮抗氧化应激所致骨质疏松并通过PI3k/Akt通路减少成骨细胞的凋亡

王秉义 潘剑

兰州大学第二医院骨科，甘肃 兰州 730030

近年来，骨质疏松发病率也呈增加的趋势，骨质疏松已经成为一个世界性的公共卫生问题[1]。氧化应激作为骨质疏松的一个危险因素己受到高度重视，各种类型的骨质疏松的发病过程中都伴随氧化应激水平的升高和凋亡的发生[2,3]。因此，具有抗氧化活性的物质有可能是防治骨质疏松的新靶点[4]。讫今为止，研究最多的天然抗氧化治疗骨质疏松的药物是白藜芦醇[5]。白藜芦醇能够清除细胞内的ROS，减缓衰老进程并可维持骨密度。丹参中丹参素等水溶性酚酸类成分是天然抗氧化有效成分，结构和白藜芦醇极其相似，含有多个酚经基，可以提供活性氧阻止脂质过氧化反应，能提高机体SOD活性，清除ROS，减少ROS对机体细胞造成的损害，改善细胞缺血缺氧，可预防心脑血管疾病[6]。本文探究丹参素拮抗氧化应激造成成骨细胞凋亡的作用，为骨质疏松的治疗提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 实验动物

4月龄清洁级SD大鼠60只，雌性，体重为(240±10)g，置于安静、恒温恒湿、无强光刺激的环境中饲养。大鼠由兰州大学实验动物中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK(甘)2013-0006。

1.2 主要试剂与设备

醋酸拨尼松(批号060328)，广东华南药业；丹参素(纯度>85%，批号20140816)，鸿生生物；白藜芦醇(纯度>98%，批号20140908)，鸿生生物；一抗(Bax、AIF、cyto-C、pAkt及β-action)，美国Santa Cruz公司；PI3K抑制剂Ly294002(批号：K1047)，Cayman Chemical公司；胰酶、山羊抗兔IgG-HRP、Western免疫印迹的化学发光检测试剂盒，购自美国Sigma公司；α-MEM培养基购自GIBco公司。双能X线骨密度检测仪(Lunar美国)，Western blot发光与凝胶成像系统，美国ALPHA公司；XYJ80-2低速离心机，江苏南京金坛恒丰仪器厂；D37520高速离心机，德国Heraeus公司；电泳仪，美国Biorad公司；电泳槽，美国Biorad公司；SDS_B型倒置生物显微镜，中国重庆光电仪器有限公司。

1.3 大鼠分组与给药

将60只雌性大鼠随机分为6组：正常对照组、模型组、丹参素高中低剂量组(30、20、10 mg/kg 体重)和对照药白藜芦醇组(5 mg/kg 体重)，每组10只。模型组给大鼠灌胃醋酸泼尼松5mg/kg 体重，给药体积为10 mL/kg，用0.5%CMC-Na配制0.5mg/mL的浓度。正常对照组大鼠每天灌注同样体积的0.5%CMC-Na。丹参素组和白藜芦醇组每日先给予模型组同样剂量的醋酸泼尼松，之后分别给予丹参素和白藜芦醇。均按给药体积为10 mL/kg，用0.5%CMC-Na配制。以上给药每日次，上午给予醋酸拨尼松，下午给予受试药物，连续14w。

1.4 骨密度BMD测定

麻醉处死动物后取右股骨、第四腰椎骨，-4 ℃保存备用。测定时待骨组织自然恢复至室温，采用双能X线骨密度仪进行骨密度测定。

1.5 细胞培养及分组

小鼠成骨细胞MC3T3-E1培养于含10 %的α-MEM培养基当中，置于37 ℃，体积分数5%的细胞培养箱中培养，胰酶常规传代。实验分为4组：A组(正常组)不加任何处理；B组(醋酸泼尼松组)加入终浓度为5 μg/mL 醋酸泼尼松；C组(醋酸泼尼松+丹参素干预组)加入终浓度为20 μg/mL，D组(醋酸泼尼松+丹参素+Ly294002组)加入终浓度为20 μmol/mL的Ly294002。

1.6 骨组织切片原位末端转移酶标记法(TUNEL)染色

取各组大鼠部分骨组织，进行石蜡包埋。在视交叉后1～4 mm处切取10 μm冠状位骨组织片，每隔4片选取1片，每只大鼠选取5片备用。进行常规脱蜡水合之后加入蛋白酶K(蛋白酶K终浓度为0.8mg/mL)，于37 ℃水浴孵育30 min。每个待检测样本中加入50μL TUNEL反应混合液(按照TdT：荧光素标记dUTP为1：9的比例配制)。每组样本中加入100 μL DNase I反应液，加入含有HRP的荧光素抗体进行37 ℃水浴孵育30 min，采用二氨基联苯胺(DAB)进行染色，经苏木素复染之后，于400倍显微镜下观察细胞凋亡。如若镜下出现细胞核成桔红色、细胞质不着色、染色质呈块状凝聚或者裂解为颗粒状的细胞，即为阳性染色细胞。根据骨组织细胞凋亡指数(AI)的计算公式，骨组织细胞凋亡指数(AI)=阳性细胞数/(阳性细胞数+阴性细胞数)×100%。

1.7 免疫荧光检测成骨细胞MC3T3-E1中pAkt表达水平

当细胞生长到90%融合时，用0.25%的胰酶消化细胞，均匀传代后，以密度为5×104的细胞密度铺24空板。第二日早晨分为不同组别进行加药处理。将孔板分为4组，每组6个孔，加药培养24 h。将长好细胞的孔板用PBS冲洗3次，每次10 min。再以4%的多聚甲酵固定1 h。固定好的孔板再用PBS冲洗3次，每次10 min。加入0.2%的曲拉通作透化处理，PBS冲洗后以5%BSA溶液在37 ℃水浴中封闭50 min。在吸尽封闭液后加入(1∶200)的p-AKT抗体在4 ℃条件下孵育过夜。用PBS缓冲液冲洗孔板，吸取一抗残液，避光下加入FITC标记的二抗，37 ℃解育1 h后在加入(1∶100)的Hest33342染核处理，经过PBS冲洗后在突光显微镜下观察，并拍照。

1.8 Western blot 实验

从上述各组大鼠骨组织中以及成骨细胞MC3T3-E1分别提取总蛋白，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳后转移蛋白至NC膜上，进行脱脂奶粉封闭2 h之后用PBS洗膜，分别加入一抗(Bax、AIF、cyto-C和pAkt)(1∶1000稀释)，4 ℃孵育过夜。进行常规洗膜之后，加入II抗即辣根过氧化酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG抗体(1∶2000稀释)并置于室温中反应1 h。经洗膜之后采用Image J软件测定各条带的灰度值，以目的蛋白条带灰度值与相应的β-actin灰度值的比值作为Bax、AIF、cyto-C和pAkt蛋白的表达水平。

1.9 统计学处理

2 结果

2.1 各组大鼠骨密度BMD测定

与对照组相比，模型组大鼠腰椎、右股骨的BMD值均有降低(P<0.05)，给予低、中、高剂量的丹参素及白藜芦醇治疗后BMD值逐渐升高，差异具有统计学意义(P<0.05)，低、中剂量丹参素与白藜芦醇差异明显，高剂量丹参素与白藜芦醇差异不明显，见表1。

表1 各组大鼠中骨密度BMD值±s，n=10)Table 1 BMD of rats in each group (±s，n=10)

注：与对照组相比，*P<0.05；与模型组相比，**P<0.05

2.2 各组大鼠骨组织中细胞凋亡指数

从图1中可以看出，与正常对照组(0.193±0.023%)相比，模型组骨组织中阳性细胞数目最多，细胞核呈桔红色，细胞质不着色、染色质呈块状凝聚或者裂解为颗粒状，细胞凋亡指数最大(0.741±0.026%)(P<0.05)；与模型组相比，丹参素各剂量组(从高剂量到低剂量依次为0.385±0.071%、0.296±0.069%、0.193±0.075%)和白藜芦醇组(0.286±0.053%)骨组织中细胞凋亡均明显减少(P<0.05)。

图1 各组大鼠骨组织中细胞凋亡检测Fig.1 The apoptosis in rat bone tissue in each group

2.3 各组大鼠骨组织中Bax、AIF、cyto-C蛋白表达量

如表2所示，与正常对照组相比，模型组大鼠骨组织中凋亡相关蛋白Bax、AIF、cyto-C表达量明显增加(P<0.05)；与模型组相比，丹参素各剂量组和白藜芦醇组骨组织中细胞凋亡相关蛋白Bax、AIF、cyto-C表达量均明显减少(P<0.05)，低、中剂量丹参素与白藜芦醇差异明显，高剂量丹参素与白藜芦醇差异不明显，有统计学意义。

表2 各组大鼠骨组织中Bax、AIF、cyto-C蛋白表达量±s，n=10)Table 2 The expression of Bax, AIF, and cyto-C protein in rat bone tissue in each group (±s，n=10)

注：与对照组相比,*P<0.05；与模型组相比,**P<0.05

图2 各组大鼠骨组织中Bax、AIF、cyto-C蛋白表达Fig.2 The expression of Bax, AIF, and cyto-C protein in rat bone tissue in each group

2.4 免疫荧光检测各组成骨细胞MC3T3-E1中pAkt的表达情况

如图3所示，从免疫荧光结果看，A组和B组 pAkt蛋白无明显区别，而C组pAkt蛋白表达明显比B组增加，D组pAkt蛋白表达明显比C组减少。

2.5 成骨细胞MC3T3-E1中Bax、AIF、cyto-C和pAkt的表达情况

从Western-blot检测蛋白表达结果看，B, D 2组中Bax、AIF和cyto-C蛋白表达明显增高，分别与A组、C组相比差异有显著性意义(P<0.05)。而C组与B组相比调亡相关蛋白Bax、AIF和cyto-C的表达明显降低。差异有显著性意义(P<0.05)。然而，A、B两组中pAkt表达量相比并无显著差异，C组pAkt表达量明显高于D组(P<0.05)。

图3 各组成骨细胞MC3T3-E1中pAkt免疫荧光表达Fig.3 The immunofluorescence expression of pAkt in MC3T3-E1 cells in each group

图4 各组成骨细胞MC3T3-E1中Bax、AIF、cyto-C和pAkt的表达Fig.4 The expression of Bax, AIF, cyto-C, and pAkt proteins in MC3T3-E1 cells in each group

组别BaxAIFcyto-CpAktA组0.145±0.0230.136±0.0240.129±0.0220.203±0.019B组0.786±0.021*0.769±0.016*0.698±0.021*0.302±0.015C组0.256±0.014#0.325±0.018#0.295±0.034#0.732±0.013D组0.732±0.021**0.699±0.018**0.678±0.016**0.296±0.024**

注：与A组相比,*P<0.05；与B组相比,#P<0.05；与C组相比,**P<0.05

3 讨论

骨质疏松症(osteoporosis)是一种以骨量低下，骨微结构损坏，导致骨脆性增加，易发生骨折为特征的全身性骨病[7,8]。在骨质疏松的发病过程中，氧化应激(ROS)甚至凋亡都扮演了重要的角色，各型的骨质疏松中都普遍伴有不同程度的成骨细胞调亡和氧化应激[9,10]。氧化应激通过抑制成骨细胞前体细胞成熟，使成骨细胞分化率明显降低[11]，通过对成骨细胞的矿化作用的抑制[12]，诱导其凋亡。氧化应激也通过对骨髓基质细胞系和成骨细胞前体细胞系的分化的抑制发挥作用[13-15]。众所周知，长期大剂量应用糖皮质激素(Glucocorticoid, GO)能够诱导继发性骨质疏松，即糖皮质激素也是诱发机体产生氧化应激并导致生理功能受阻的重要因素[16, 17]。因此拮抗成骨细胞的凋亡以及氧化应激反应，可以发挥减少骨质疏松现象的作用[18]。

天然抗氧化剂丹参素是丹参中的一种水溶性多酚酸类成分，具有抗骨质疏松的作用[19, 20]。PI3K/AKT信号传导通路作为细胞生长，分化，凋亡等细胞生理代谢的常见通路[21]。为了探究丹参素抗骨质疏松的作用是否与拮抗细胞凋亡以及PI3K/AKT信号传导通路有关，在本研究中，我们采用醋酸泼尼松制备大鼠骨质疏松模型，探究了丹参素对骨质疏松大鼠中骨组织细胞凋亡指数以及凋亡相关蛋白表达的影响。白藜芦醇是目前治疗骨质疏松常用药物，因此被研究中采用白藜芦醇处理组作为阳性对照组。从图1和图2可以得知，丹参素能够抑制醋酸泼尼松诱导骨质疏松大鼠中骨细胞的凋亡，明显降低细胞凋亡蛋白Bax、AIF、cyto-C的表达，并且呈现剂量依赖性关系。与白藜芦醇组相比，不同浓度丹参素处理组对骨质疏松大鼠中骨细胞凋亡的拮抗能力各不相同，随着剂量浓度增加而增加。这表明丹参素对骨质疏松大鼠具有保护作用，并且高剂量丹参素处理组对骨质疏松大鼠保护能力高于白藜芦醇组。对于其机制研究，我们发现丹参素能够上调成骨细胞MC3T3-E1中pAkt的表达，这表明PI3k/Akt通路在丹参素拮抗成骨细胞MC3T3-E1的凋亡过程中起到关键作用。通过抑制该通路之后，丹参素的抗凋亡作用大大被抑制。因此，我们推断丹参素拮抗骨质疏松中骨细胞的凋亡是通过PI3k/Akt通路发挥作用的。但丹参素抗调亡的作用方式可能不是唯一的。它可能通过其他方式发挥作用。它或许激活了许多与凋亡相关的酶类，例如某些锌指蛋白。也可能通过某些细胞因子起作用，如胰岛素生长因子，转移因子等等。这些还都待进一步研究。本研究发现的丹参素拮抗氧化应激引起的成骨细胞的凋亡，这可能会是治疗骨质疏松的新途径，期待在未来的应用中得到检验。